癌症基因體分析的基礎生物學

為什麼重要

M1 先以 HP1／HP2、founder clone 與 subclone 作為圖示標籤，以呈現整體資料流。 本模組將進一步區分這些標籤，並建立較精確的生物學資料模型。

這些術語形式相近，但所指的資料層級不同。常見混淆是將 variant 與 allele、 或 genotype 與 haplotype 混用，因而難以精確解讀文獻與資料格式。

自學閱讀時，可先將下列五個詞對應至資料結構的不同層級： 地址、該地址的一種值、與參考不同的事件、單一地址的兩份值、跨多個地址的一整串值。 先掌握概念層級，再對應英文術語。

概念與互動

五個容易混用的詞

上表以正常二倍體常染色體為模型，因此同一個 locus 通常有兩份 allele。 這種具有兩份拷貝的狀態稱為 diploiddiploid 二倍體正常人多數常染色體區段通常有兩份拷貝的狀態；性染色體、拷貝數變化與腫瘤細胞可能不同。A state in which a typical autosomal locus has two copies. Sex chromosomes, copy-number-altered regions and tumour cells may differ.完整條目 →；性染色體與腫瘤拷貝數異常將於後續模組另行處理。

關鍵差別在最後兩個：genotype 是單一位置的，haplotype 是跨越多個位置的。 genotype 說「這裡有一份 A、一份 G」，但沒說 A 跟隔壁位置的 C 是不是在同一條染色體上。 補上這個資訊，正是 phasingphasing 定相為可判定的 variants 建立其位於不同實體染色體拷貝上的相位關係；VCF 常以 0|1 等形式表示。長 read 可提供跨位點的分子層級觀測證據。Determining which variants lie on the same physical chromosome, turning 0/1 into 0|1. Long reads provide direct molecular evidence.完整條目 → 要推定的關係之一。

VCF 可用下列符號表示這項差異：

phasing 會以 reads 或統計模型推定等位基因在不同染色體拷貝上的歸屬； VCF 可使用豎線表示已推定的相位結果。

heterozygous 位點提供主要 phasing 資訊

一個 locus 若兩份 allele 不同（heterozygousheterozygous 異型合子在一般二倍體位點上，兩份 allele 不同（例如一份 A、一份 G）。此類位點可作為區分 haplotype 的資訊錨點；複雜拷貝數情況需另行解讀。At a typical diploid locus, carrying two different allele copies (for example A and G). These sites can anchor phasing; copy-number changes require separate interpretation.完整條目 →，例如 0/1）， 在讀取品質足夠的簡化模型中，可用來區分兩條 haplotype —— 看到 A 的 read 可歸到一條，看到 G 的可歸到另一條。

若兩份相同（homozygoushomozygous 同型合子在一般二倍體位點上，兩份 allele 相同。此位點本身通常無法用來區分兩條 haplotype。At a typical diploid locus, carrying two identical allele copies. The site itself usually cannot distinguish haplotypes.完整條目 →），該位點本身通常不能區分兩條 haplotype。

het 位點密度是影響 phasing 的因素之一；讀長、coverage 與錯誤率也會影響可建立的相位範圍。

腫瘤中的 LOHLOH 異型合子性喪失原本 heterozygous 的區域變成只剩一種 allele。LOH 不等於缺失 —— 也可能是一條 haplotype 遺失後另一條被複製（copy-neutral LOH）。Loss of heterozygosity: a formerly het region retains only one allele. Not necessarily a deletion.完整條目 →（loss of heterozygosity，異型合子性喪失）可能使一個區段失去其中一種 allele， 使原本可用的 heterozygous 位點減少，因而降低可用的 phasing 錨點。

因此，僅依這些錨點的 phasing 在 LOH 區段會更困難，可能需要其他證據或專門方法； 實際影響取決於 LOH 型態、coverage、purity 與演算法。

germline 與 somatic

在特定 somatic calling 流程中，germline calls 常被排除；然而 heterozygous germline SNPSNP 單核苷酸多型性族群中以多型形式存在的單一鹼基差異；本教材主要以可作為 phasing 錨點的 germline SNP 為例。A single-nucleotide polymorphism observed as a population variant. This tutorial mainly uses germline SNPs as phasing anchors.完整條目 → 也可作為建立 haplotype 骨架的錨點之一。錨點不足時，區分 HP1／HP2 及連結 somatic 變異會更困難。

clone 與 subclone

回到 M1 的簡化區段模型。一個細胞取得突變後增生，形成一群共享可辨識突變的細胞，稱為 cloneclone 克隆源自共同祖先細胞，並共享一組可辨識 somatic mutations 的細胞群。A population of tumour cells descended from a common ancestor and sharing the same set of somatic mutations.完整條目 →。 其中某些細胞又取得新突變、再擴增，就形成 subclonesubclone 次克隆clone 內取得額外變異並擴增的子群；治療後可能富集具有抗性的 subclone。A subset of a clone that acquired further mutations and expanded. Treatment-resistant populations are often subclones.完整條目 →。

許多 somatic 變異可能是 passenger；可提高生長或存活優勢的候選變異稱為 driver mutationdriver mutation 驅動突變可提升腫瘤細胞生長或存活優勢的候選變異；passenger mutation 通常不具有已知的選擇優勢。A mutation that confers a growth advantage, as opposed to the far more numerous passenger mutations.完整條目 →， 其判定需依癌別與功能證據。

治療可能改變不同細胞群的相對比例，使具有抗藥優勢的 subclone 富集：

因此，除列出腫瘤中的變異外，也需評估這些變異可能分布於哪些細胞群。 這種細胞組成的不均勻，就叫 intratumour heterogeneityintratumour heterogeneity 腫瘤內異質性同一腫瘤內不同細胞可帶有不同突變組合，因而同時存在多種基因型。Different cells within one tumour carrying different mutation combinations.完整條目 →。

真實證據

評估方法時需有可供對照的高可信度參考標註。 truth set 通常由多種技術與證據建立，但仍可能包含不確定區域；benchmark 還包含評估範圍與程序。

以下列出六個具有參考標註的癌症細胞株作為示例：

這些細胞株具有可用的配對正常樣本與參考標註，可提供區分 germline 與 somatic 的重要對照； 實際判定仍受 coverage、污染、變異類型與參考集品質影響。

HCC1395 將於後續示例中再次出現；可比較兩份資料： HCC1395_HKU 與 HCC1395_NYGC，同一個細胞株、不同的 basecallerbasecalling 鹼基判讀把定序儀的原始訊號（ONT 是電流）轉成 A/C/G/T 字母的步驟。不同 basecaller 版本會產生不同的錯誤特性 —— 所以「同一個細胞株、不同 basecaller」是兩份不同的資料集。Converting raw sequencer signal into A/C/G/T. Different basecallers yield different error profiles.完整條目 → 與分析流程。 兩份資料的組成相似度（0.909）可作為跨流程一致性的觀察，但不能單獨證明方法穩健性。 因此，provenanceprovenance 資料來源履歷記錄資料來源、細胞株、定序平台、basecaller、reference build、caller、benchmark 與混樣方式。在本實驗室中，這些資訊是重要實驗變數，而非附註。The full origin record of a dataset. In this lab it is a first-class experimental variable, not metadata.完整條目 → 應視為重要實驗變數，而非附註。

判讀練習

練習與自我檢核

三項概念檢核

可先自行回答，再核對下方解析：

1. 「這個位置有一份 A、一份 G」—— 這句話講的是 genotype 還是 haplotype？
2. 0|1 比 0/1 多告訴你什麼？
3. 為什麼 heterozygous 位點通常比 homozygous 位點更能提供 phasing 資訊？

答案依序是：genotype（單一位置）／多告訴你「哪一份在哪一條染色體上」／ 因為兩份 allele 不同時，才提供區分兩條染色體的訊號；homozygous 位點通常無法單獨區分。

在實際資料中檢查

若已有一份 VCF，可使用下列指令檢查 genotype 分布：

# 各種 genotype 各有多少個
bcftools query -f '%POS\t[%GT]\n' sample.vcf | cut -f2 | sort | uniq -c | sort -rn

# 只留下 heterozygous 的位點（phasing 能用的錨點）
bcftools view -g het sample.vcf | grep -vc '^#'

het 位點密度會影響 phasing，亦需同時考慮讀長、coverage 與品質。 人類全基因體中的 het 位點通常為數百萬量級，但會因族群、參考基因組、callable region 與過濾條件而異；請以資料集統計為準。