Germline variant calling：從證據到判定

為什麼重要

本課程後續工具多以 caller 輸出的候選變異為輸入，進一步進行篩選或校正。 因此需要先理解 caller 的輸出內容與限制。

germline calling 的情境相對單純：一個人只有兩條染色體，變異要嘛在其中一條、要嘛兩條都有。 本節在這個單純的情境下把 caller 的判斷方式講清楚，M07 再處理腫瘤帶來的額外因素。

概念與互動

變異檢測variant calling從已比對 read 中判斷哪些位置具有足夠證據支持變異存在的過程，通常輸出 VCF。Deciding which positions genuinely carry variants, given aligned reads. Outputs a VCF.完整條目 →的判斷內容

某個位置有 30 條 read 支持 A、28 條支持 G。這組數字可以提出 heterozygous 候選， 但不能單獨定案 —— 因為同樣的 30 比 28，畫面可以完全不同：

所以 caller 讀的不是兩個數字，而是這個位置的整張畫面 —— 把覆蓋此處的 read 排成一張表（一列一條 read、一欄一個位置，這種排法叫 pileup）， 再把表上每個格子的資訊編碼成好幾層數值送進模型。Clair3Clair3以深度學習做 germline variant calling 的工具，長 read 上常用。A deep-learning germline variant caller widely used for long reads.完整條目 → 與 DeepVariantDeepVariantGoogle 開發的 germline variant caller，把 pileup 轉成影像再用 CNN 分類。Google's germline variant caller; encodes pileups as images and classifies them with a CNN.完整條目 → 都是這種做法：

兩個工具的內部步驟不同：DeepVariant 把「做數值」「跑模型」「寫 VCF」拆成三個程式； Clair3 則先用輕量模型掃過所有位置，只把信心不足的少數位置交給看完整比對的模型重判。

把 read 先分成兩群，判斷就變簡單了

前面那張畫面還有一個沒用上的線索：這些 read 分別來自哪一條染色體。 一個人的每個位置有兩條染色體，一條來自父親、一條來自母親。 把 read 依這兩條分成兩群（也就是 phasingphasing 定相為可判定的 variants 建立其位於不同實體染色體拷貝上的相位關係；VCF 常以 0|1 等形式表示。長 read 可提供跨位點的分子層級觀測證據。Determining which variants lie on the same physical chromosome, turning 0/1 into 0|1. Long reads provide direct molecular evidence.完整條目 →），同一個畫面會變得好判斷得多：

關鍵在一致性，不在數量。真的 heterozygous 變異只存在於其中一條染色體上， 所以那一群的每一條 read 都應該帶著它；隨機的定序錯誤沒有這個約束，會零星散落在兩群裡。 這個判準對錯誤率較高的平台（例如部分 ONT 資料）特別有用 —— 那正是單看計數最不可靠的情形。

這也解釋了一個看起來矛盾的地方：明明要先有變異才能 phasing，怎麼又說 phasing 幫助 calling？ 因為兩者是來回兩次：先用最有把握的位點做一次 calling，用它們把 read 分群， 再把 HP 標籤HP tagBAM 裡標示某條 read 屬於哪一條 haplotype 的 tag。LongPhase-S 的 germline haplotag 寫成整數 HP:i:1；somatic haplotag 與 LongPhase-TO 則寫成字串 HP:Z:1-1。BAM tag assigning a read to a haplotype. Integer HP:i:1 for germline haplotag; string HP:Z:1-1 for somatic.完整條目 →當成模型的額外輸入重判一次。Clair3 的 full-alignment 階段與 PEPPER-Margin-DeepVariant 都採用這個順序。

同一個「集中或分散」的線索在腫瘤資料裡會再出現一次，只是那時要判斷的不只是真假， 還包括這個變異長在哪一條 haplotypehaplotype 單倍型同一條實體染色體拷貝上，具有一致相位的一組 alleles 或 variants。HP1 與 HP2 是任意的相對標籤。A set of variants that lie on the same physical chromosome copy and are inherited together.完整條目 → 上 —— 需要的證據也更多。以下這張圖先把最重要的陷阱說清楚： 兩種情況的支持 read 總數可以幾乎一樣，所以不能靠數量判斷。

真實證據

本教材示例使用 Clair3Clair3以深度學習做 germline variant calling 的工具，長 read 上常用。A deep-learning germline variant caller widely used for long reads.完整條目 →；部分流程也會使用 PEPPER-Margin-DeepVariant。 以下提供一組示範指令：

docker run \
  -v "${INPUT_DIR}":"${INPUT_DIR}" \
  -v "${OUTPUT_DIR}":"${OUTPUT_DIR}" \
  kishwars/pepper_deepvariant:r0.7 \
  run_pepper_margin_deepvariant call_variant \
  -b "${INPUT_DIR}/alignment.bam" \
  -f "${INPUT_DIR}/reference.fasta" \
  -o "${OUTPUT_DIR}" \
  -t 10 \
  --ont_r9_guppy5_sup

最後的 --ont_r9_guppy5_sup 是與特定 ONT 化學版本／basecaller 資料相容的模型選項。 R10 與 PacBio HiFi 應依所用版本文件選擇相容模型（例如 --ont_r10_q20 或 --hifi）。 模型不匹配可能降低效能，且流程未必報錯；請將平台、basecaller 與模型版本記錄於 provenanceprovenance 資料來源履歷記錄資料來源、細胞株、定序平台、basecaller、reference build、caller、benchmark 與混樣方式。在本實驗室中，這些資訊是重要實驗變數，而非附註。The full origin record of a dataset. In this lab it is a first-class experimental variable, not metadata.完整條目 →。

在本教材流程中，germline VCF 產生後，再由後續 phasing 工具使用其中的 heterozygous 位點作為錨點。 這是本流程的先 call、再 phase 順序；其他工具可能採用不同的整合方式。

判讀練習

實作練習

執行一次 germline calling

# Clair3（Docker 範例；請依環境調整路徑）
docker run -v "${INPUT_DIR}":"${INPUT_DIR}" -v "${OUTPUT_DIR}":"${OUTPUT_DIR}" \
  hkubal/clair3:latest \
  /opt/bin/run_clair3.sh \
  --bam_fn="${INPUT_DIR}/aln.bam" \
  --ref_fn="${INPUT_DIR}/reference.fasta" \
  --threads=10 \
  --platform="ont" \
  --model_path="/opt/models/ont" \
  --output="${OUTPUT_DIR}"

模型應與定序化學版本、basecaller 與工具版本相容。模型不匹配可能降低效能， 且未必觸發錯誤；請在執行前核對模型文件，並將設定記錄於 provenance。

檢查結果的合理性

取得 VCF 後，先進行以下基本合理性檢查：

# 變異總數；典型高品質人類全基因體 callset 約為數百萬筆，實際值依篩選條件而異
bcftools view -H out.vcf | wc -l

# het 與 hom 的比例；實際值依族群、平台與篩選條件而異
bcftools view -H -g het out.vcf | wc -l
bcftools view -H -g hom out.vcf | wc -l

# SNV 與 indel 的比例；實際值依平台與篩選條件而異
bcftools view -H -v snps out.vcf | wc -l
bcftools view -H -v indels out.vcf | wc -l

這些統計若明顯偏離同類資料的預期，可能提示 coverage、模型相容性、參數、過濾條件或樣本品質問題。 請先檢查原因，再進行 phasing，以降低問題在後續流程中傳遞的風險。

原始文獻與程式碼

• Clair3：Zheng Z 等，Symphonizing pileup and full-alignment for deep learning-based long-read variant calling，Nature Computational Science，2022。程式碼在 github.com/HKU-BAL/Clair3。
• DeepVariant：Poplin R 等，A universal SNP and small-indel variant caller using deep neural networks，Nature Biotechnology，2018（doi 10.1038/nbt.4235）。程式碼在 github.com/google/deepvariant。