Somatic variant calling：tumor–normal 與 tumor-only

為什麼重要

本模組比較兩種分析設計：有配對正常樣本的 tumor–normal（TN）模式， 以及只有腫瘤樣本的 tumor-only（TO）模式。是否有 matched normal 會改變可用的對照證據與不確定性。

差異不只是少一個輸入檔案；它會改變可辨識的變異類型與後續判讀方式。

概念與互動

同一批 read，兩種對照，兩種輸出

先把整件事放在一張圖裡。下圖的上下兩排腫瘤 read 完全相同—— 同樣六條 read、同樣四個候選位置。唯一改變的是右邊拿什麼當對照：

請注意這張圖真正的重點：位置 ① 與 ③ 都是這個人天生就有的 germline variantgermline variant 生殖系變異在生殖系形成、通常存在於多數細胞的變異；可遺傳給子代，但不代表必然傳遞。A variant arising in the germline and therefore present in essentially every cell of the individual. It may be inherited or arise de novo, and may be passed to offspring.完整條目 →， 在腫瘤樣本裡長得一模一樣（各三條支持、VAF 都是 0.5）。它們的命運不同， 不是因為變異本身有什麼差別，而是因為資料庫知不知道它。

位置 ④ 兩種模式都留得住，那是我們要的 somatic variantsomatic variant 體細胞變異在非生殖系細胞譜系中、通常於受精後取得的變異；可只存在於部分細胞，通常不由親代遺傳給子代。癌症基因體學常分析此類變異。A variant acquired outside the germline, usually after conception. It may be restricted to a subset of cells and is generally not passed to offspring; it is a central focus of cancer genomics.完整條目 →。 caller 產生的是 候選變異candidate 候選變異caller 提出、但尚未被確認的變異位點。本實驗室多數工具位於 caller 之後，進行再校正，處理的就是這些 candidates。A proposed but unconfirmed variant. Most tools in this lab post-process the caller's candidate set.完整條目 →，還不是最終答案；本教材以 ClairSClairS配對 tumor–normal 的 somatic variant caller。tumor-only 版本叫 ClairS-TO。A somatic variant caller for matched tumour–normal data; ClairS-TO is the tumour-only version.完整條目 →、DeepSomaticDeepSomaticGoogle 的 somatic variant caller，同樣有 tumor-only 版本。Google's somatic variant caller, also available in a tumour-only mode.完整條目 → 作為 tumour-normaltumour-normal 配對腫瘤／正常同時定序病人的腫瘤與正常組織；正常樣本提供個體 germline 背景，有助於辨識 somatic 候選。Sequencing a patient's tumour alongside their normal tissue, which supplies the germline background.完整條目 →（TN）calling 的範例，tumour-onlytumour-only 僅腫瘤只有腫瘤樣本、沒有配對正常樣本。在成本或檢體受限時很常見，但少了 germline 對照，分析難度會大幅提高。Having only the tumour sample. Common for cost or specimen reasons, but much harder without a germline baseline.完整條目 →（TO）則以 ClairS-TO 為例， 實際輸入與過濾流程請依版本文件確認。

沒有正常組織時，改用什麼當對照

在部分臨床或研究情境，matched normal 可能因成本、檢體量或取得條件而缺失。 替代方案是公開的族群資料庫：利用 allele frequency 與已知變異紀錄提供 germline 線索。 本教材在 LongPhase-TO／ClairS-TO 情境中將這組集合稱為 PONPON 正常樣本面板／族群資料庫（依流程而異）PON 依分析流程有兩種用法，兩者不可互換：本教材的 tumor-only 流程以它指稱 population germline database set（如 1000G、CoLoRSdb、dbSNP、gnomAD 的聯集）；GATK Mutect2 的 Panel of Normals（PoN）則由多個正常樣本建立，用來標記反覆出現的技術性 artifact。兩者都不能完全取代同一病人的 matched normal。The abbreviation is workflow-dependent and the two uses are not interchangeable. In this tutorial's tumour-only workflows, PON denotes a population germline database set; in GATK Mutect2, a Panel of Normals (PoN) is built from multiple normal samples to flag recurrent technical artifacts. Either can miss a private germline variant or an unseen artifact, so neither replaces a patient's matched normal.完整條目 →（population database set）， 它包含 1000 Genomes、gnomAD、dbSNP、CoLoRSdb 等來源。

上圖下排的橫軸就是這件事的關鍵。資料庫有一個收錄門檻—— 實際下載的檔名裡寫著 af-ge-0.001，意思是只收頻率 0.001 以上的位點。 位置 ① 的族群頻率 0.31，遠高於門檻，查得到；位置 ③ 只有 0.0002，落在門檻左邊， 資料庫裡根本沒有這一筆。「族群常見」與「這個人有」不是同一件事，缺口就從這裡來。

在 GATK Mutect2 語境，PoN 通常指由多個正常樣本建立的 recurrent-artifact panel。 名稱相同、內容不同 —— 而且更重要的是，這兩種資料各守住一個方向，中間會留下一格：

下方元件用同一組候選點數一次數量，看 precision 怎麼掉下來：

TN calling 也不是把兩個 VCF 相減

前面那張圖為了講清楚缺口，把 TN 流程畫得很乾淨：normal 有訊號就排除。 實務上不能這樣做，而且失準的地方在有配對正常樣本時就已經發生：

TINC：normal 裡的訊號強度說明三種不同的事

第一項值得單獨看一次，因為它最容易被寫成錯的規則。下圖三欄的腫瘤樣本完全相同 （24 條 read、6 條帶變異、VAF 都是 0.25），差別只在配對正常樣本裡有幾條：

VAF 可作為輔助訊息，但實際值取決於 purity、copy number、zygosity、multiplicity、 clonality 與 depth（完整關係式見 M8）。因此不能只用「有沒有訊號」或單一固定門檻判定。

沒有正常組織時，還剩下什麼證據

回到那張 PONPON 正常樣本面板／族群資料庫（依流程而異）PON 依分析流程有兩種用法，兩者不可互換：本教材的 tumor-only 流程以它指稱 population germline database set（如 1000G、CoLoRSdb、dbSNP、gnomAD 的聯集）；GATK Mutect2 的 Panel of Normals（PoN）則由多個正常樣本建立，用來標記反覆出現的技術性 artifact。兩者都不能完全取代同一病人的 matched normal。The abbreviation is workflow-dependent and the two uses are not interchangeable. In this tutorial's tumour-only workflows, PON denotes a population germline database set; in GATK Mutect2, a Panel of Normals (PoN) is built from multiple normal samples to flag recurrent technical artifacts. Either can miss a private germline variant or an unseen artifact, so neither replaces a patient's matched normal.完整條目 → 涵蓋不到的左下角。要把住在同一格裡的三種東西分開， 必須換一個問法：不再問「這個位置別人有沒有」，而是問「支持它的那些 read，彼此的結構像不像一次真的突變」。

真的變異一定是從某一條既有的 haplotypehaplotype 單倍型同一條實體染色體拷貝上，具有一致相位的一組 alleles 或 variants。HP1 與 HP2 是任意的相對標籤。A set of variants that lie on the same physical chromosome copy and are inherited together.完整條目 → 上長出來的，所以支持它的 read 應該集中在一條 haplotype 上。如果同一個「變異」的支持 read 分散在兩條染色體上， 那等於同一個位置各獨立突變了一次 —— 機率極低，更像比對或定序造成的問題：

一句話總結

真實證據

TN calling 指令示範

docker run \
  -v ${INPUT_BAM_DIR}:${INPUT_BAM_DIR} \
  -v ${OUTPUT_DIR}:${OUTPUT_DIR} \
  -u $(id -u):$(id -g) \
  hkubal/clairs:v0.4.1 \
  /opt/bin/run_clairs \
  --normal_bam_fn ${INPUT_BAM_DIR}/normal.bam \
  --tumor_bam_fn  ${INPUT_BAM_DIR}/tumor.bam \
  --ref_fn ${INPUT_REF_DIR}/reference.fasta \
  --threads 64 \
  --platform ont_r10_dorado_sup_5khz_ssrs \
  --output_dir ${OUTPUT_DIR}

TO 模式：準備 population database set

mkdir PoN
BASE=http://www.bio8.cs.hku.hk/clairs-to/databases
wget -P PoN $BASE/gnomad.r2.1.af-ge-0.001.sites.vcf.gz
wget -P PoN $BASE/dbsnp.b138.non-somatic.sites.vcf.gz
wget -P PoN $BASE/1000g-pon.sites.vcf.gz
wget -P PoN $BASE/CoLoRSdb.GRCh38.v1.1.0.deepvariant.glnexus.af-ge-0.001.vcf.gz

注意：有些文件把資料夾變數寫成 PATH="PoN" 再使用 $PATH；這會覆寫 shell 的可執行檔搜尋路徑。此處改用 BASE， 實際參數仍應依工具版本文件核對。

四個檔案名稱（gnomad、dbsnp、1000g、 CoLoRSdb）都指向族群 germline 資料庫，與本教材的 population database set 定義一致；它不同於 GATK Mutect2 所稱的 recurrent-artifact PoN。 其中兩個檔名帶著 af-ge-0.001 —— 那就是前面那張圖裡的收錄門檻， 低於這個頻率的位點不在檔案裡，所以查不到。

判讀練習

實作練習

比較兩種 calling 設計的結果

此練習比較 paired 與 tumor-only 的輸出差異。若有配對資料，可在相同參考序列與 相近過濾設定下執行兩種模式，再比較結果：

# isec 要求 bgzip 壓縮＋索引，少了索引會直接報錯
bcftools index -f paired.vcf.gz
bcftools index -f tumoronly.vcf.gz

# 配對模式找到、而僅腫瘤模式未找到的候選（數量依資料與設定而異）
bcftools isec -C paired.vcf.gz tumoronly.vcf.gz | wc -l

# 僅腫瘤模式多出的候選（可能包含 private germline、artifact 或 paired caller 漏報）
bcftools isec -C tumoronly.vcf.gz paired.vcf.gz | wc -l

若檔案還是未壓縮的 .vcf，先 bcftools view -Oz -o out.vcf.gz in.vcf 轉成 bgzip 格式再建索引；一般的 gzip 壓出來的檔案 bcftools index 不接受。

檢查多出來的候選是什麼

上面第二條指令的輸出，就是本模組那張圖裡的位置 ③。逐項檢查它們：

下面第 2 步先講一件事再看指令：HP 標籤的型別依工具而異。 longphase-s haplotag 寫的是整數 HP:i:， somatic_haplotag 與整個 longphase-to 寫的是字串 HP:Z:。 只 grep 其中一種，另一種資料會安靜地數出 0，所以下面用 HP:[iZ]: 同時涵蓋兩者。

# 1) 在配對正常樣本裡數這個位置的 ref/alt read —— 接近一半提示 private germline
#    第 5 欄是每條 read 在該位置讀到的字母，可以直接數（. 與 , 代表與參考相同）
samtools mpileup -f reference.fasta -r chr1:1000000-1000000 normal.bam

# 想要精確數字而不是用眼睛數，讓 bcftools 把 AD 欄挖出來
bcftools mpileup -f reference.fasta -r chr1:1000000-1000000 -a AD normal.bam \
  | bcftools query -f '%POS\t%REF\t%ALT\t[%AD]\n'

# 2) 支持 read 落在哪一條 haplotype 上
#    haplotag 過的 BAM 裡直接數 HP 標籤；兩邊都有支持就要提高疑慮
samtools view tumor.haplotagged.bam chr1:1000000-1000000 \
  | grep -oE 'HP:[iZ]:[12]' | sort | uniq -c

第 1 步的兩道指令是同一件事的兩種讀法：samtools mpileup 給的是可以用眼睛看的 pileup 字串，bcftools mpileup 給的是 VCF —— 後者預設不帶 allele depth， 所以要加 -a AD 才數得出來。

兩項要合起來看。VAF 接近 0.5 可提示 private germline， 但仍需排除污染、比對偏差與其他模型不確定性；haplotype 分布可提示 artifact， 但真的兩次獨立突變或 phasing error 都會造成例外。沒有單一證據可以定案。

原始文獻與程式碼

• ClairS（tumour-normal）：ClairS: a deep-learning method for long-read somatic small variant calling，bioRxiv，2023。程式碼在 github.com/HKU-BAL/ClairS。
• ClairS-TO（tumour-only）：ClairS-TO: a deep-learning method for long-read tumor-only somatic small variant calling，Nature Communications，2025。程式碼在 github.com/HKU-BAL/ClairS-TO。
• DeepSomatic：Accurate somatic small variant discovery for multiple sequencing technologies with DeepSomatic，Nature Biotechnology，2025。程式碼在 github.com/google/deepsomatic。