腫瘤樣本的混合組成

為什麼重要

到目前為止，「腫瘤樣本」在流程裡就是一袋 read。但那袋 read 來自一堆混在一起的細胞： 有癌細胞，也有正常細胞；癌細胞之間彼此也不完全相同；而且同一個位置在不同細胞裡可能有不同的 DNA 份數。

結果就是：同一個觀測到的數字，可以由好幾種不同的細胞組成算出來。 所以這一章的第一件事，是把 purity、copy number、multiplicity、CCF 這幾個名詞各自「在數什麼」講清楚 —— 它們常被混用，而混用會直接讓結論出錯。

概念與互動

先把名詞跟「在數什麼」對起來

這些名詞看起來很多，但它們其實只做一件事：在不同層級上數東西。 puritytumour purity 腫瘤純度樣本中腫瘤細胞所佔的比例。purity 越低，somatic 訊號被正常細胞稀釋得越嚴重，偵測越困難。The fraction of cells in a sample that are tumour cells. Low purity dilutes somatic signal.完整條目 → 與 CCFcancer cell fraction 癌細胞比例帶有某個特定突變的腫瘤細胞佔全部腫瘤細胞的比例。用來區分 clonal（$\approx 1$）與 subclonal（$<1$）突變。不等於 VAF。The fraction of tumour cells carrying a given mutation; distinguishes clonal from subclonal. Not the same as VAF.完整條目 → 數的是細胞； copy numbercopy number 拷貝數某段基因體在細胞內的拷貝數。多數正常常染色體區段為 2，可再分為 major 與 minor allele copy number。How many copies of a genomic segment a cell carries; a typical diploid autosomal segment has two. It can be split into major- and minor-allele copy numbers.完整條目 → 與 multiplicitymutation multiplicity在帶有某突變的細胞中，該突變所占的拷貝數；是 VAF 與 cancer cell fraction 換算時的重要參數。How many mutant-allele copies are present in a cell carrying the mutation; a necessary term when converting VAF to cancer cell fraction.完整條目 → 數的是一個細胞裡有幾份 DNA； VAFVAF 變異等位基因頻率在某個位點上，支持 alt allele 的 read 佔全部 read 的比例。VAF 不等於帶有這個突變的細胞比例。Variant Allele Frequency: the fraction of reads supporting the alternate allele. Not the same as the fraction of cells carrying it.完整條目 → 數的是read。搞混它們，通常就是搞混了分母。

下面用一個玩具檢體把三層對齊：10 個細胞，其中 6 個是腫瘤細胞， 腫瘤細胞裡有 3 個帶著我們要看的那個突變，每個細胞在這個位置都有 2 份 DNA。

這張圖裡有兩件事值得停下來看。

第一，方向是不對稱的。給定上面兩層，VAF 只有一個答案 —— 腫瘤佔 0.6、其中一半帶突變、每個細胞 2 份裡帶 1 份，算出來就是 $0.6\times 0.5÷2=0.15$。 但拿著 $\mathrm{VAF}=0.15$ 往上反推，會有很多組合都成立。整章的難處都在這個不對稱上。

第二，read 不是細胞。一條 read 是一個 DNA 分子，同一個細胞會貢獻很多條 read， 而且哪一條 read 來自哪個細胞在 bulk 資料裡查不到。所以「數 read」永遠只是「數細胞」的間接代理。

copy number、multiplicity 與 ploidy：一個位置有幾份

中間那層最容易被跳過，但它是後面所有推論的地基。三個詞的差別很小、影響很大： copy number 是「這一段在一個細胞裡有幾份」，multiplicity 是「其中幾份帶著這個突變」， ploidyploidy 倍性細胞內染色體套數。多數正常常染色體為 2（diploid）；腫瘤可呈現 3、4 或其他非整倍體狀態。The number of chromosome sets in a cell. Most normal autosomal regions are diploid (2); tumours may be triploid, tetraploid or otherwise non-diploid.完整條目 → 是「把整個基因體的 copy number 平均起來」。

為什麼要分這麼細？因為同一個突變、同樣「每個腫瘤細胞都有」， 只要拷貝狀態不同，VAF 就完全不同：

把「腫瘤細胞佔多少」「一個細胞有幾份」「突變佔幾份」「多少腫瘤細胞帶著它」四件事寫進同一個式子， 就是下一節的關係式。

VAF 的完整關係式

M1 使用了簡化情境：「purity=0.5、樣本為 diploid，且每個腫瘤細胞帶有一份變異拷貝，因此 VAF 為 0.25」。在一般情況下，關係式為：

VAF 是可由 reads 估計的觀測量；purity、totalCN、multiplicity 與 CCF 通常需由多項證據估計或推論。 這些參數之間存在可識別性限制，因此「估計腫瘤細胞比例」本身就是一個獨立的研究題目。

LOH 的常見機制及其可觀測差異

LOHLOH 異型合子性喪失原本 heterozygous 的區域變成只剩一種 allele。LOH 不等於缺失 —— 也可能是一條 haplotype 遺失後另一條被複製（copy-neutral LOH）。Loss of heterozygosity: a formerly het region retains only one allele. Not necessarily a deletion.完整條目 → 是「原本 heterozygous 的區域只剩下一種 allele」。 但其形成機制不只一種；以下比較兩類常見情形：

低 purity 對 somatic variant detection 的影響

回到最上面那一層。purity 低的時候，突變本身沒有變少，但它在整池 DNA 裡被稀釋， 落到 read 上就只剩幾條支持：

以下把最左邊那一格算清楚：50× coverage、purity 0.2，以及一個 clonal 的 diploid somatic 變異：

因此預期僅有約五條支持 read。ONT 的錯誤率受 basecaller、序列脈絡與 read 品質影響； 在此深度下，少量錯誤 read 可能與變異訊號重疊，降低可分辨性。

這說明 LongPhase-S 為何採用 purity 感知的過濾：低 purity 通常需要重新校準過濾參數， 並以驗證資料在 sensitivity 與 precision 間取得平衡。

在 LongPhase-S 的此實作中，流程先估計 purity，再依 purity 調整過濾參數；其他方法也可能採用聯合或迭代估計。

真實證據

LongPhase-S 以 ASCAT 作為 purity 估計的比較基準。ASCAT 是常用的 allele-specific copy-number、purity 與 ploidy 估計方法； 具體適用範圍與資料平台應依研究設計說明。

該研究報告 LongPhase-S 在低 purity 合成樣本上的估計誤差多數低於 10%， 交叉驗證 MAE 約 4%、$R^2$ 約 0.95；解讀時應同時確認誤差定義、資料集與切分方式。

這項比較僅涵蓋合成樣本，且假設來源 tumor BAM 接近純腫瘤。 細胞株仍可能包含少量正常或異質細胞，因此此假設限定了 purity 結果的適用範圍。

先提出預測，再查看解答

實作練習

合成不同 DNA fraction 的混合樣本

以下是評估混合樣本穩健性的常用設計之一：

# 1. 先量測兩個 BAM 的有效 coverage
mosdepth --by 500 tumor_cov  tumor.bam
mosdepth --by 500 normal_cov normal.bam

# 2. 依實測 coverage 回推抽樣率（-s 的格式是 seed.fraction）
#    抽樣率 =（目標 fraction × 合成後總深度）÷ 來源深度 —— 推導與五個梯度的數值見 M3
#    以 tumor 50×、normal 25×、總深度 25×、目標 DNA fraction 0.6 為例：
samtools view -s 1.30 -b tumor.bam  > t_sub.bam
samtools view -s 1.40 -b normal.bam > n_sub.bam

# 3. 合併
samtools merge dna_frac_0.6.bam t_sub.bam n_sub.bam
samtools index dna_frac_0.6.bam

可建立 0.2 / 0.4 / 0.6 / 0.8 / 1.0 五個 DNA fraction 梯度， 以評估方法在低 DNA fraction 條件下的效能變化；這是一組常見的基礎評估設計。

以 heterozygous 位點密度初步篩查 LOH

# 計算沿染色體分箱的 het 位點密度
# 需與配對 normal、鄰近可呼叫區域及 coverage 比較，以列出 LOH 候選
bcftools view -H -g het sample.vcf | awk '{print $1, int($2/1000000)}' | \
  sort | uniq -c | awk '{print $2, $3, $1}' | head -40

可呼叫區域的 het 密度受樣本、族群、coverage、caller 與過濾條件影響，應以配對 normal 或鄰近區段建立基線。 若某區段密度顯著低於基線，可列為 LOH 候選；purity 混合可能保留部分 het reads，仍需結合 allele balance、coverage 與其他證據。