甲基化入門

為什麼重要

一條 ONT read 除了序列，還帶著一串「這個 C 有沒有被加上甲基」的紀錄。 這件事的用處不只是「多一種資料」：同一群細胞的甲基化模式會比較像， 所以甲基化其實是一個關於「這條 read 來自哪一群細胞」的線索 —— 而 bulk 資料本來查不到這件事。

實驗室有兩個題目用到這個線索，但用法剛好相反： 一個把它當成判斷依據（會影響結果），另一個刻意不讓它影響判斷（只當事後註記）。 這一章先講清楚兩個題目各自在做什麼，再談為什麼其中一個要刻意不用。

概念與互動

5mC：序列之外的表觀遺傳資訊

5mC5mC 5-甲基胞嘧啶胞嘧啶第 5 個碳上的甲基化修飾。這是常見的 DNA 甲基化形式，主要見於 CpG；可影響轉錄調控，效應依基因組位置與細胞類型而異。5-methylcytosine, the commonest DNA methylation mark, usually at CpG sites. Affects expression without changing sequence.完整條目 → 是在胞嘧啶（C）的 5 位碳上加上甲基。在序列字母表示上，它不改變 C 的識別； 5mC 可與基因調控及表現相關，但作用取決於基因組脈絡。

在哺乳類，5mC 主要集中於 CpGCpG序列上一個 C 後接一個 G（p 代表兩者之間的磷酸鍵）。哺乳類多數 5mC 位於 CpG，特定細胞或情況亦可見非 CpG 甲基化。A cytosine followed by a guanine. Most mammalian 5mC occurs at CpG sites, although non-CpG methylation is also observed in particular cells and contexts.完整條目 → 位點（一個 C 後面接著一個 G），但也可能出現在非 CpG 脈絡。 在本節的分析中，基本單位是「某個 CpG 位點上，一條 read 的 methylated 或 unmethylated 狀態」。

bisulfite-seq 是測量甲基化的常用方法之一，會將未甲基化的 C 轉換為 U（在定序中通常讀為 T），流程較為繁複。 ONTONT 奈米孔定序Oxford Nanopore Technologies。以電流訊號讀取 DNA，可產生長 read；在 native-DNA 流程與適當模型下，可由訊號推定 5mC，通常不需 bisulfite 轉換。Oxford Nanopore Technologies. Reads DNA through ionic-current signals, producing long reads. With native DNA and a suitable model, 5mC can be inferred without bisulfite conversion.完整條目 → 可利用電流訊號搭配修飾辨識模型推定 5mC，通常不需 bisulfite 前處理； 在完成修飾辨識且保留 MM/ML 後，同一條 read 可同時提供序列變異與甲基化狀態。

這些資料在程式裡是什麼形狀

先把資料結構看清楚，後面兩種用法就都好懂了。 一條 read 在一個區域內會經過好幾個 CpG 位點，每個位點上它是 methylated 或 unmethylated —— 所以一條 read 就是一個 0／1 向量，一個區域就是一張 read × CpG 的表。

用法一：當作證據 —— 判斷一個候選是不是 somatic

第一個題目是 tumor-only 的 somatic 變異判讀：手上有一堆候選位置，要決定哪些是真的 somatic 變異。 甲基化在這裡派上用場的理由很具體 —— somatic 變異只存在腫瘤細胞裡，所以帶著它的那些 read 全部來自同一群細胞， 而不帶它的 read 則來自腫瘤與正常細胞的混合。兩側的甲基化組成因此會不一樣。

實際的特徵有三類：兩側各自的甲基化覆蓋量與其差距、每一側是單一還是混合的比例， 以及把兩側的平均甲基化程度畫成散布圖後的形狀差異。 分類器（XGBoost）本身不懂生物學，它只是學會「這幾個數字長這樣時，候選通常是真的」。

用法二要用到的任務：subclone 重建在做什麼

第二個題目常被術語擋住，但它的核心其實是一個很單純的組合問題。

腫瘤細胞一代一代分裂，過程中只會多拿到突變，不會把突變還回去。 所以拿一個小區域、看其中 k 個 somatic 位置，每個細胞在這 k 個位置上就是一個 0／1 向量； 一個細胞分裂出的後代，向量只會多出幾個 1。

bulk 定序給你的每一條 read，就是這些向量的一次取樣（read 夠長才能同時覆蓋好幾個位置）。 於是問題變成：已知看到了哪些向量，什麼樣的「一次翻一個 0→1」的路徑能最省步數地產生它們？ 那條路徑就是這個區域的候選演化順序。

這樣看的話，subclone 重建的輸出就是「這個區域內、突變發生順序的候選解」， 而不是一棵完整的腫瘤演化樹。也因為是最小成本解，並列的候選會全部保留，不強行選一個。

同一個狀態裡，read 還能再分群

現在把甲基化接回第二個題目。假設一群 read 的 haplotype 相同、在每個 somatic 位置上的 0／1 向量也完全相同 —— 依序列來看它們是「同一個狀態」，無法再分。 但它們的甲基化模式可能明顯分成兩群：

可觀察到：ALT reads 仍可再分成兩群。 它們的 allele 與 haplotype 相同，僅依序列無法區分，但甲基化模式可能不同。

這個現象稱為 within-ALT residual structure；研究依其統計定義，在七個資料集中將其量化為主要殘餘變異來源（51.2%–80.4%）。 換句話說：固定 haplotype 與 allele 後，仍可觀察到額外的 read-level 甲基化分群。

它的意義是：上一節那棵樹的一個節點裡，可能還藏著更細的分群 —— 序列證據已經用完了，但資料還沒說完。這正是甲基化在第二個題目裡的位置： 它標記已經建好的節點，而不參與建樹。

兩種角色的對照

兩個題目用的是同一份 read × CpG 表，但甲基化在流程裡的位置完全不同：

為什麼用法二要刻意不用？因為那個題目最想知道的，正是「這棵樹對不對」。 如果甲基化已經幫忙選過樹，再拿甲基化差異來說「看，這棵樹的分支確實有甲基化差異」， 那只是把自己的輸入念一次而已 —— 這是循環論證。

同一個原則也適用於用法一：那裡的甲基化已經進了模型，所以評估模型效能時 必須用沒有參與訓練的資料，不能拿甲基化特徵本身當成「模型是對的」的證據。

真實證據

實務限制之一是甲基化資料的覆蓋範圍。這裡要留意計數單位：M2 列出的是六個細胞株， 而評估用的是資料集，同一株可能有多份（HCC1395 的 HKU 與 NYGC）。 以細胞株計，六個裡只有五個有可用的甲基化資料；以資料集計則多於五份。 不論用哪個單位，能做甲基化分析的樣本都比能做序列分析的少； 因此甲基化較適合作為區域層級的補充證據，而非唯一判準。

研究統計各資料集中帶有穩定甲基化差異的 sSNV 位點比例， COLO829 為 9.5%、H2009 為 35.4%，資料集間差異明顯。不可評估的主要限制之一是 ALT read 的 coverage 不足； 要估計兩組甲基化差異，兩邊都需要足夠且相對平衡的 reads。

先提出預測，再查看解答

實作練習

甲基化資訊存在 BAM 的哪裡

前面那張 0／1 表不是憑空來的，它從 BAM 的兩個 tag 讀出來：

samtools fastq -T '*' methylcall.raw.bam > raw.fastq
minimap2 -ax map-ont -y reference.fasta raw.fastq

確認 BAM 是否包含甲基化資料

先確認必要的 MM/ML tags，以免後續修飾分析缺少資料：

# 抽查一條 read 是否包含 MM / ML tags
samtools view methyl.bam | head -1 | tr '\t' '\n' | grep -E '^(MM|ML|Mm|Ml):'

# 統計帶有 MM tag 的 reads（抽查多條 reads，不只查看第一條）
total=$(samtools view -c methyl.bam)
withmod=$(samtools view methyl.bam | grep -c 'MM:Z:')
echo "$withmod / $total 條 read 帶甲基化 tag"

若第二個數字為 0，先確認原始 BAM 是否已完成修飾辨識及 tag 命名格式；可能是尚未呼叫修飾，也可能在前處理中遺失。可用以下流程重新保留 tags：

samtools fastq -T '*' original.bam > with_tags.fastq
minimap2 -ax map-ont -y reference.fasta with_tags.fastq | \
  samtools sort -o remapped.bam && samtools index remapped.bam

提取並統計甲基化訊號

# 產生每個 CpG 位點的甲基化比例（bedMethyl 格式）
modkit pileup methyl.bam output.bed --ref reference.fasta

# 依 haplotype 分開統計（需要先 haplotag）
modkit pileup methyl.bam out_hp.bed --ref reference.fasta --partition-tag HP

--partition-tag HP 可將甲基化依 haplotype 分層統計， 以比較兩條 haplotype 的甲基化模式。依 M6 所述，haplotype 方向僅在同一 phase block 內一致， 因此統計應限制於同一 phase block，或先完成方向校正。

在 IGV 中檢視甲基化

在支援 base-modification 且 BAM 含有效 MM/ML、參考序列與相容版本時，IGV 可顯示 ONT 甲基化。載入 BAM 之後右鍵 → Color alignments by → base modification (5mC)。 搭配前面的 Group by phase，即可同時檢視 haplotype 與甲基化資訊。