LongPhase-TO（tumor-only）

為什麼重要

上一章的做法需要兩份樣本：腫瘤一份、同一個病人的正常組織一份。 有了正常樣本，「這個變異是不是癌細胞才有的」就有直接的參照 —— 正常樣本裡也看得到的，本來就有，不是癌症造成的。

實務上常常只拿得到腫瘤那一份。這時候少掉的不只是一個檔案，是整個對照組。 看到一個候選變異，你沒有辦法直接回答「這個人本來就有嗎」。

LongPhase-TOLongPhase-TOtumor-only 版本。做染色體等級的 LOH 偵測、triplet graph 再校正、somatic phasing 與腫瘤 DNA 比例估計。The tumour-only version: chromosome-scale LOH detection, triplet-graph recalibration, somatic phasing and purity estimation.完整條目 → 換了一種證據：不比對兩個樣本，改看同一批 read 內部的結構。 一條 long readlong read 長讀單條可達數千至數萬鹼基的定序片段（例如 ONT、PacBio）。若可靠地同時覆蓋多個 variant，可提供它們位於同一 DNA 分子上的直接觀測證據。A sequencing read thousands to tens of thousands of bases long. Its length lets one molecule link multiple variants directly.完整條目 → 一次跨過好幾個位置，所以「哪些 allele 綁在同一條分子上」這件事， 只有腫瘤樣本時仍然看得見。這一章就是在講它怎麼把這個結構當成缺席的對照組來用。

概念與互動

先看整件事的形狀

這個工具只有一個主要指令，但它一次做完四件事。 先把這四件事的順序記住，後面每一節都是在把其中一格放大。

第一件事：哪些區段只剩一條染色體

人的每個位置本來有兩份，一份來自父親、一份來自母親。 腫瘤細胞常常整段整段地弄丟其中一份，這叫 LOHLOH 異型合子性喪失原本 heterozygous 的區域變成只剩一種 allele。LOH 不等於缺失 —— 也可能是一條 haplotype 遺失後另一條被複製（copy-neutral LOH）。Loss of heterozygosity: a formerly het region retains only one allele. Not necessarily a deletion.完整條目 →。 LOH 區段對後面每一步都有影響，所以要先找出來。

怎麼找？看一個很簡單的數字：這個區段裡，「兩份不一樣」的位置佔多少。 兩份都在的時候，一個人身上大約每一千個鹼基就有一個位置是一邊 A、一邊 G， 這種位置叫 雜合heterozygous 異型合子在一般二倍體位點上，兩份 allele 不同（例如一份 A、一份 G）。此類位點可作為區分 haplotype 的資訊錨點；複雜拷貝數情況需另行解讀。At a typical diploid locus, carrying two different allele copies (for example A and G). These sites can anchor phasing; copy-number changes require separate interpretation.完整條目 →。少了一份之後，這些位置只剩一種 allele，比例就會塌下來。

為什麼小事件非扣不可？因為一段大 LOH 裡面常常夾著幾個小的重排 （BFBBFB 斷裂—融合—橋循環Breakage-fusion-bridge：染色體反覆斷裂與融合造成的劇烈重排，在 coverage 上呈現特殊的階梯形狀。Breakage-fusion-bridge: repeated chromosome breakage and fusion producing characteristic coverage staircases.完整條目 → 這類劇烈斷裂—融合就會製造這種局部訊號）。這些小區間裡雜合位點會短暫回來， 把比例墊到門檻之上。不處理的話，程式會以為那裡不是 LOH，於是把一段連續的區域報成三段不相干的區域。

第二件事：這個候選變異是真的嗎

候選變異不是 LongPhase-TO 自己叫出來的 —— 那是 ClairSClairS配對 tumor–normal 的 somatic variant caller。tumor-only 版本叫 ClairS-TO。A somatic variant caller for matched tumour–normal data; ClairS-TO is the tumour-only version.完整條目 →-TO 或 DeepSomatic-TO 的工作。 LongPhase-TO 做的是再校正（recalibrationrecalibration 再校正以額外證據重新評估 caller 已輸出的 candidates。若僅處理既有候選，可移除 false positives，但不能恢復 caller 未輸出的變異。Re-judging a caller's candidates with extra evidence. When the candidate set is fixed, it can remove false positives but cannot recover variants the caller never emitted.完整條目 →）：把明顯不合理的候選挑掉。

第一關很直接：拿去對 PONPON 正常樣本面板／族群資料庫（依流程而異）PON 依分析流程有兩種用法，兩者不可互換：本教材的 tumor-only 流程以它指稱 population germline database set（如 1000G、CoLoRSdb、dbSNP、gnomAD 的聯集）；GATK Mutect2 的 Panel of Normals（PoN）則由多個正常樣本建立，用來標記反覆出現的技術性 artifact。兩者都不能完全取代同一病人的 matched normal。The abbreviation is workflow-dependent and the two uses are not interchangeable. In this tutorial's tumour-only workflows, PON denotes a population germline database set; in GATK Mutect2, a Panel of Normals (PoN) is built from multiple normal samples to flag recurrent technical artifacts. Either can miss a private germline variant or an unseen artifact, so neither replaces a patient's matched normal.完整條目 → 這種族群資料庫比。 大家都有的變異，多半是這個人與生俱來的，不是癌症造成的，先排除掉。 但族群資料庫收不到每個人的私有變異，所以過了這一關還不夠。

第二關才是重點，而且它用的證據只有 long read 給得起： 看支持這個候選的 read，左右兩邊的鄰居是什麼。

背後的理由是癌症怎麼發生的。一個體細胞變異只會發生在某一個細胞的某一條染色體上， 之後那個細胞分裂出來的後代才帶著它。所以真變異必然掛在一條既有的 haplotype 底下， 形成一條「跟母體只差一格」的新路徑。定序錯誤沒有這個身世，它落在哪條 read 上是隨機的。

實際上一個候選點周圍不會只取一組三位點。程式會拿它左右幾個變異輪流搭配， 組出很多組三位點，每一組各自看一次、各投一票，最後看票數決定留不留。 一組看走眼不會定生死，這是把單一雜訊的影響攤掉的常見做法。

第三件事：把每個變異掛回染色體

前兩件事做完，才輪到定相本身。做法跟 M11 一樣 —— 把「同一條 read 上看到的 allele」連成一張圖，再沿著圖走出兩條 haplotype。 差別在這裡多做兩件事：somatic 變異也要一起掛上去，而且LOH 區要接得過去。

結果寫在 VCF 的 FORMAT 欄位，分成三層。用下面的解碼器把七種常見組合逐一看過一次：

為什麼 LOH 區要多一層？因為那裡只剩一條 germline haplotype 可以掛， 但癌細胞在那一條上可能先後長出兩批不同的變異，屬於不同的細胞群。 只有 GT2 一格的話，這兩批會被混在一起；多一層 GT3 才分得開。

第四件事：這個樣本有多少比例是腫瘤

檢體不會是純的癌細胞，裡面一定混著正常細胞。混得多寡直接影響每個變異的訊號強度， 所以這個比例要估出來。M12 用的是 GHIRGHIR 生殖系單倍型失衡比Germline Haplotype Imbalance Ratio：在候選 somatic 位點上，取標為 HP1 與 HP2 的 read 數中較大者除以兩者之和，值域為 0.5 至 1。須注意兩件事：分母只含這兩個 germline 計數，HP1-1／HP2-1／HP3 皆不在內；且這些標籤是整條 read 的判定（該 read 任一處帶 somatic 等位即離開 germline 計數），並非該位點的等位計數。它不是直接的 purity 讀數：拷貝數變異、LOH、read 跨距內的突變密度、標記錯誤與抽樣不足都會使它偏移。Germline Haplotype Imbalance Ratio: at a candidate somatic locus, the larger of the HP1 and HP2 tagged read counts divided by their sum, ranging from 0.5 to 1. Two caveats: the denominator contains only those two germline counts, excluding HP1-1/HP2-1/HP3; and those tags are whole-read decisions (a read carrying a somatic allele anywhere leaves the germline counts), not per-locus allele counts. It is not a direct purity readout — copy number, LOH, mutation density within the read span, tagging error and sparse sampling all shift it.完整條目 →；這裡的比值算法一樣，差別只在數的是帶 reference allele 的 read。

最後一步是把兩樣東西交給一條事先訓練好的式子：全基因體所有位置的比值分布， 加上 LOH 佔了基因體多少。為什麼要加 LOH 這一項？因為 LOH 區本身就會把比值推向 1.0 （那裡本來就只剩一條），只看比值分布會高估。兩個特徵一起看，才對得起來。

真實資料與證據

longphase-to phase \
  -s SNP.vcf \
  -b tumor.bam \
  -r reference.fasta \
  -t 8 \
  -o phased_prefix \
  --caller clairs_to_ssrs \
  --pon-file PoN/gnomad.vcf.gz,PoN/dbsnp.vcf.gz \
  --strict-pon-file PoN/1000g-pon.vcf.gz \
  --loh

怎麼看輸出

# 估出來的腫瘤比例寫在 VCF 檔頭
grep '##tumor_purity' phased_prefix.vcf

# LongPhase-TO 加上去的 FILTER 標籤分布
awk '!/^#/ {print $7}' phased_prefix.vcf | sort | uniq -c

# LOH 區間
head phased_prefix_LOH.bed

FILTER 欄位會出現 PASS、LP_nonSomatic 或 LP_PON： 分別是留下來的、被三位點投票否決的、被族群資料庫擋掉的。 加上 --disable-refine-somatic 就不做這一步，可以用來看再校正到底改了哪些位置。

預測與結果檢視

實作練習

跑一次，然後檢查四個輸出

longphase-to phase \
  -s tumor_snv.vcf \
  -b tumor.bam \
  -r reference.fasta \
  -t 8 \
  -o phased_prefix \
  --caller clairs_to_ssrs \
  --pon-file PoN/gnomad.vcf.gz,PoN/dbsnp.vcf.gz \
  --strict-pon-file PoN/1000g-pon.vcf.gz \
  --loh

# ① LOH 一共佔了多少基因體？
awk '{s+=$3-$2} END {print "LOH 總長度:", s/1e6, "Mb"}' phased_prefix_LOH.bed

# ② 估出來的腫瘤比例
grep '##tumor_purity' phased_prefix.vcf

# ③ 有 somatic 事件的位置（GT2 不是 ./.）
bcftools query -f '%POS\t[%GT\t%GT2\t%GT3]\n' phased_prefix.vcf | \
  awk '$3 != "./."' | head -20

# ④ 其中有幾個落在 LOH 區裡（GT 帶點）
bcftools query -f '[%GT\t%GT2]\n' phased_prefix.vcf | \
  awk '$2 != "./." && $1 ~ /\./' | wc -l

③ 跑出來如果有一堆 1|1，代表很多位置判不出來源， 通常是覆蓋度或 read 長度不足；④ 的數字跟 ① 的 LOH 長度應該是相關的， 兩者兜不起來就值得回頭看 LOH 是不是切得太碎。

把圖印出來看

longphase-to phase ... --dot -o phased_prefix

加 --dot 會另外輸出一個 Graphviz 的 .dot 檔， 裡面就是這一章講的那張「節點是 allele、邊是 read 支持」的圖。 自己畫出一小段來看，比讀十遍說明有用。

追程式碼時的對照表

四件事在原始碼裡各有明確的落點。PhasingProcess.cpp 的建構子 從上往下讀就是整個流程，其他檔案都是被它叫起來的：

程式碼

LongPhase-TO 的程式碼在 github.com/CCU-Bioinformatics-Lab/longphase-to； 截至本教材撰寫時尚未有對應論文，參數與行為以原始碼的 longopts 表為準。