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Capstone：整合式位點判讀

整合單一位點的多項證據，完成可重現的推論流程，並撰寫明確標示不確定性的結論。

約 120 分鐘建議先修：LongPhase-TO

本模組學習目標

獨立判讀一個位點的所有證據，並得出有根據的結論
在有配對正常樣本與只有腫瘤樣本兩種情境下做出不同的判斷，並說明理由
在同一個位點上跑完兩種流程，並在各自的輸出檔案裡找到答案
計算 precision 與 recall，並指出它們在這個案例裡的限制
寫出一段明確區分「觀測到的」與「推論出來的」結論

為什麼重要

前面十四個模組各自處理一件事。這一節把它們放回同一個位點上，要求你自己判讀，而不是照著步驟做。

評量的重點不是指令跑不跑得動，是你的解讀有沒有證據撐住。 實務上要說清楚三件事：你觀測到什麼、你從觀測推論出什麼、以及哪些結論還受資料或模型限制。這三件事混在一起寫，別人就無法判斷你有幾分把握。

概念與互動

案例：chr9 上的一個候選點

給定條件：

項目	值
樣本	HCC1395（乳癌細胞株），ONT R10
位置	`chr9:5,073,770`，落在 JAK2 基因範圍內
候選變異	SNV，`G → T`
Tumor coverage	50×，其中 11 條支持 ALT
Normal coverage	25×，其中 0 條支持 ALT
估計 purity	0.6（本題簡化模型中視為 tumor DNA fraction）
該區段 copy number	2（無 CNV，無 LOH）
周圍 200 bp 內的 het germline SNP	2 個，皆已 phase
支持 ALT 的 11 條 read 的 HP tag	10 條 HP1、1 條 HP2
序列脈絡	非 homopolymer、非重複區
PON	不在任何族群資料庫中

完整推理鏈示例

左：逐項檢查五類證據，標示其定性支持程度。右：改用僅有腫瘤樣本的情境時，第二類證據不可用；下方比較兩種情境的結論表述與確定程度。

任務一：是否為 somatic 變異？

請先列出支持與反對的理由，再展開解析。

展開答案

結論：目前證據與 somatic 變異相容，支持度較高。證據如下：

支持的證據：

VAF 與簡化模型相容。觀測 VAF = 11/50 = 0.22。在 tumor DNA fraction = 0.6、diploid、無拷貝數變化、單拷貝且 clonal 的合成假設下，理論預期為 $0.6 \times 1 \div 2 = 0.30$ 。0.22 略低於此值，可能與 CCF 約 0.73 的次要 clone 或取樣波動相容；這不是對 CCF 的直接量測。
normal 樣本未觀測到 ALT。25× 深度、0 條 ALT。若此位點是典型 het germline，在相同覆蓋與取樣假設下原本可預期約一半 read 支持 ALT；觀測到 0 條會降低此解釋的可能性，但不能僅憑此結果完全排除 germline。
haplotype 來源偏向一致。11 條中有 10 條是 HP1。這支持 ALT read 集中於一個 haplotype，但仍需結合 mapping/base quality、read 證據數量與 haplotagging 品質判讀，不能單獨視為證明。
序列脈絡未見已知高風險特徵。此處不是 homopolymer 或重複區，因而降低部分 ONT 錯誤來源的疑慮；這項觀察不足以排除所有 SNV 誤差。

需要保留的疑慮：

那 1 條 HP2 read 可能反映定序、比對或 haplotagging 誤差，也可能是更複雜的局部訊號。 10:1 仍偏向單一來源；若比例更接近 1:1，單一 haplotype 的解釋就會減弱。
purity 0.6 是模型估計值而非直接量測值。如果估計偏差，「VAF 與預期相容」這項證據也會隨之改變。
11 條 read 的絕對數量不算多。統計波動的空間仍在。

任務二：如果沒有 normal 樣本呢？

同一個位點，但你只有 tumor BAM。判斷會怎麼改變？

展開答案

確定程度會下降，因為缺少配對 normal 的直接比較。

上面四條支持證據裡，第二條（normal 未觀測到 ALT）不可用，因此排除 germline 的能力較弱。

剩下能用的：

PON 查詢 —— 不在這個族群資料庫裡，會降低常見 germline 的可能性，但排除不了病人私有的 germline 變異（M7 的核心限制）。
VAF 0.22 —— 在沒有拷貝數、LOH 或 purity 偏差的簡化 diploid 假設下，典型 het germline 的 VAF 通常接近 0.5；實際腫瘤樣本的 VAF 仍可能受這些因素影響，因此 tumor-only 下不能以單一 VAF 值作出定論。
haplotype 結構 —— 這是 LongPhase-TO 主要利用的證據。用左右兩個 germline SNP 建 triplet graph，看支持這個候選的 read 是不是都落在同一條 haplotype 上（M13 的第二件事）。本例 10:1 偏向 HP1，符合這個樣態。

因此結論可寫成：「目前證據與 somatic 變異相容，但無法完全排除私有 germline 變異」 —— 並在報告中明確標示這項限制。

這也是 tumor-only 研究需要特別報告 precision 的原因之一：族群資料庫無法涵蓋所有個體特異的 germline 變異。

任務三：算一次效能

假設你在這個 chr9 評估資料集上跑完流程，並與所採用的 SEQC2 truth set 比對後得到：

先將結果分為 TP、FP、FN，再說明 precision、recall 與 F1 各自使用哪些計數。以下數值僅適用於本例的評估設定：若 FP 減半且未誤刪 TP，precision 增加 0.080，而 F1 增加 0.024；recall 不變。

算出 precision、recall、F1。然後回答：如果你加一個後處理過濾器，把 FP 從 88 降到 44，F1 會變成多少？這個改善值得嗎？

展開答案

目前：

$precision = 412 / (412 + 88) = 0.824$
$recall = 412 / (412 + 335) = 0.551$
$F 1 = 2 \times 0.824 \times 0.551 / (0.824 + 0.551) = 0.661$

把 FP 減半之後（假設未誤刪 TP，屬於理想化情境）：

precision = 412/456 = 0.904（+0.080）
recall = 0.551（不變）
F1 = 0.685（只有 +0.024）

值得注意的是這兩個數字動的幅度差很多。precision 增加 8 個百分點， F1 只動了 2.4 個百分點 —— 因為 FN（335）遠多於 FP（88）， F1 被 recall 那一側綁住了。只要 FN 一直是大宗，再怎麼壓 FP，F1 都不會有大改變。

而且這仍是理想化假設。實際過濾器可能誤刪部分 TP，使 FN 增加並縮小改善幅度。

值得嗎？看你的用途：

如果下游需要人工逐一檢視候選點，precision 提升可減少需檢視的 FP 數量；實際節省幅度仍取決於資料集與工作流程。
如果你的目標是「盡量不要漏掉任何可能的 driver」，那 recall 才是關鍵，這個改善幫助有限。
如果你要在論文裡宣稱「方法變好了」，只報 F1 會低估你的貢獻，只報 precision 則是選擇性呈現。兩個都報，並解釋 FN 的組成。

最後應追查 335 個 FN 中有多少是 caller 一開始就未產生的候選。若占大多數，後處理無法補回這些事件，應改從 caller、覆蓋度或候選產生階段處理（guardrail #10）。

真實證據

同一個位點，兩種流程各跑一次

任務二是用想的，這一節要你真的跑出來看。同一份腫瘤資料跑兩次：一次帶配對正常樣本，一次假裝沒有。兩種流程把答案寫在完全不同的地方，這是新手最常卡住的一點。

配對版把每條 read 的歸屬寫成 BAM 的 HP:Z: 標籤，純度另外寫一個檔；僅腫瘤版把每個位置的歸屬寫成 VCF 的 GT2，純度寫在 VCF 檔頭，並多輸出一份 LOH 區段。兩邊對這個位點的判斷一致，但右邊少了正常組織這個直接對照。

兩個 repo 都沒有附範例資料，要自己準備一個小區段來跑。

① 有配對正常樣本

REGION="chr9:5000000-5200000"

longphase-s somatic_haplotag \
  -s phased_normal.vcf \
  -b normal.bam \
  --tumor-snv-file tumor.vcf \
  --tumor-bam-file tumor.bam \
  -r reference.fasta \
  --region "${REGION}" \
  -t 8 \
  -o capstone_sn \
  --output-somatic-vcf \
  --somatic-calling-log

# 純度寫在這個檔案裡，不會印到畫面上
grep -A2 'Estimation result' capstone_sn_purity.out

# 每條 read 被分到哪一類
samtools view capstone_sn.bam | grep -o 'HP:Z:[0-9-]*' | sort | uniq -c

② 假裝沒有正常樣本

longphase-to phase 沒有 --region 參數，所以要先把 BAM 與 VCF 切出小區段再跑：

# 先切出區段（longphase-to 不吃 --region）
samtools view -b tumor.bam "${REGION}" > tumor_sub.bam && samtools index tumor_sub.bam
bcftools view -r "${REGION}" tumor.vcf -Ov -o tumor_sub.vcf

longphase-to phase \
  -s tumor_sub.vcf \
  -b tumor_sub.bam \
  -r reference.fasta \
  -t 8 \
  -o capstone_to \
  --caller clairs_to_ssrs \
  --pon-file PoN/gnomad.vcf.gz,PoN/dbsnp.vcf.gz \
  --strict-pon-file PoN/1000g-pon.vcf.gz \
  --loh

# 純度寫在 VCF 檔頭
grep '##tumor_purity' capstone_to.vcf

# 這個位點的三層答案
bcftools query -r chr9:5073770 -f '%POS\t[%GT\t%GT2\t%GT3]\n' capstone_to.vcf

③ 把兩邊兜起來

跑完之後回答三個問題，這才是這一節的重點：

兩邊對這個位點的歸屬（HP1 還是 HP2）一致嗎？不一致的話，哪一邊的證據比較薄？
兩邊估出來的純度差多少？差距落在什麼範圍還算合理？
僅腫瘤版多報了哪些位點？其中有多少是配對版判定為 germline 的？這個差集就是失去正常樣本的代價，而且可以量出來。

用 IGV 看一眼

把 capstone_sn.bam 載入 IGV，依 HP tag 分組並跳到候選位點。要看的是：帶 ALT 的 read 是不是集中在同一條 haplotype 上，以及兩側 germline allele 是否一致。這些視覺訊號仍要跟 mapping/base quality、覆蓋度與過濾結果一起判讀，單看一張截圖不足以下結論。

判讀練習

最後一題著重於區分觀測與推論。

你在同一個區域找到三個候選 somatic 變異，而且有一條 read 同時跨過全部三個，顯示 ALT–ALT–REF。你想說「我發現了一個 subclone」。

你可以這樣寫嗎？

展開答案

不可以。這是整份教材最後要留給你的一課。

你直接觀測到的是：一個 DNA 分子片段的序列上，第一與第二個變異同時存在，第三個不存在。 這不是對細胞數量或獨立分子數量的直接計數。從這裡到「存在一個 subclone」，中間隔著三道檢查：

左上是你真正看到的，右上是不能直接跳過去的結論。中間三道檢查每一道都需要額外的證據：多條獨立 read 排除錯誤、分子數不等於細胞數（guardrail #7）、 VAF 要靠拷貝數與突變拷貝數才換算得成細胞比例。底部是三道都做完之後真正可以寫的那句話。

即使三道都做完，得到的仍是與 clone／subclone 差異相容的候選解釋，而不是已確認的細胞族群；要確認還需要拷貝數、細胞比例或單細胞／多區域資料。

重要區分 #9：latent node 不是「還沒觀察到的細胞」

subclone 重建在建立候選演化樹時，有時必須加入沒有被任何 read 直接觀測到的中間狀態，才能在模型限制下保持圖的連通性。這種節點稱為 latent node。

資料只看到 00 與 11；模型規定一條邊只能新增一個突變，所以兩點直接連不起來，必須補一個中間狀態。關鍵在最下面一行：補 10 或補 01 都能接通，資料本身分不出來該用哪一個。

所以 latent node 是模型的產物，不是資料的產物。把它當成「存在一個尚未發現的 subclone」會超出資料支持範圍；換用不同模型假設或新增資料後，該節點可能不再出現。

同理，subclone 重建的「候選拓撲」也不是完整的腫瘤演化樹：它是區域層級的、而且經常保留多個並列候選。

（承上）那麼，如何在報告中適當表述？

展開答案

建議表述：「在 chr9:5.03–5.11 Mb 區域的 HP1 family 中， read 證據支持一個分支式、多步驟的候選拓撲，其結構與 clone／subclone 的分化相容。此結果是區域層級的候選解釋，尚需單細胞或多區域資料驗證。」

這樣可明確區分觀測證據、模型推論與尚待驗證的部分。

實作練習

換一個自己的位點，從頭做一次

上一節用的是指定好的 chr9 位點。這一次自己挑一個，把整套判讀重做一遍 —— 這才是驗收。

從 capstone_to.vcf 裡挑一個 GT2 不是 ./. 的位點。刻意挑一個證據沒那麼漂亮的（例如支持的 read 只有 5、6 條，或 GT2 是 1|1）。
把該位點的觀測值全部列出來：coverage、支持 ALT 的條數、HP 分布、序列脈絡、PON 命中與否。
用任務一的五類證據逐條檢查一次。
再用任務二的方式問一次：如果沒有正常樣本，你會少掉哪一條？
用 IGV 看一眼，確認你的判讀跟畫面對得起來。

通過標準

寫一頁報告，內容包含：

你選的位點與所有觀測值
你的判斷（somatic／germline／定序錯誤）與逐條理由
如果改成只有腫瘤樣本，判斷會怎麼變、為什麼
precision 與 recall 的計算，以及它們在這個案例裡的限制
一段明確的不確定性陳述 —— 哪些結論你有信心、哪些只是「與資料相容」

第 5 點是這份教材真正要教會的事：把證據的邊界寫出來，而不是把話講滿。

延伸學習：完成 capstone 後可補哪些背景

可依研究題目選擇補充方向：

如果你的題目是	需要補的背景
配對樣本的 indel	卷積神經網路（CNN）基礎、把 pileup 編碼成影像、類別不平衡的處理
僅腫瘤樣本的 indel 或甲基化	梯度提升樹（XGBoost）、特徵工程、PCA
subclone 重建	布林超立方體、簡約演化樹、Group Steiner tree

這三列的演算法背景都是本教材尚未涵蓋的部分 —— 教材教的是怎麼判讀證據，不是怎麼訓練模型。若研究涉及這些方向，需要另外補足。

學習檢核

本模組術語

F1: precision 與 recall 的調和平均。當資料裡 FN 遠多於 FP 時，precision 的改善對 F1 的影響有限 —— 見 M10。
HP tag: BAM 裡標示某條 read 屬於哪一條 haplotype 的 tag。LongPhase-S 的 germline haplotag 寫成整數 HP:i:1；somatic haplotag 與 LongPhase-TO 則寫成字串 HP:Z:1-1。
LOH（異型合子性喪失）: 原本 heterozygous 的區域變成只剩一種 allele。LOH 不等於缺失 —— 也可能是一條 haplotype 遺失後另一條被複製（copy-neutral LOH）。
PON（正常樣本面板／族群資料庫（依流程而異））: PON 依分析流程有兩種用法，兩者不可互換：本教材的 tumor-only 流程以它指稱 population germline database set（如 1000G、CoLoRSdb、dbSNP、gnomAD 的聯集）；GATK Mutect2 的 Panel of Normals（PoN）則由多個正常樣本建立，用來標記反覆出現的技術性 artifact。兩者都不能完全取代同一病人的 matched normal。
cancer cell fraction（癌細胞比例）: 帶有某個特定突變的腫瘤細胞佔全部腫瘤細胞的比例。用來區分 clonal（ $\approx 1$ ）與 subclonal（ $< 1$ ）突變。不等於 VAF。
copy number（拷貝數）: 某段基因體在細胞內的拷貝數。多數正常常染色體區段為 2，可再分為 major 與 minor allele copy number。
precision（精確率）: 所有 calls 中實際為真陽性的比例：TP / (TP + FP)。後處理常以提升此指標為目標。
recall（召回率）: 在指定評估範圍內，所有真陽性中被找出的比例：TP / (TP + FN)。若只對固定的 caller 候選集做後處理，recall 只能維持或下降，不能恢復 caller 從未輸出的真陽性；報告時應說清楚這個候選集範圍。
triplet graph: LongPhase-TO 判斷候選變異真假時用的最小結構：候選位置加上左右各一個變異，共三個位置。把 read 上看到的 allele 組合畫成路徑後，真的 somatic 變異會形成一條「跟某一條 germline haplotype 只差候選這一格」的新路徑；定序錯誤則湊不出一致的路徑。因為左右兩側都要對得上，所以三個位置是最小單位。
tumour purity（腫瘤純度）: 樣本中腫瘤細胞所佔的比例。purity 越低，somatic 訊號被正常細胞稀釋得越嚴重，偵測越困難。