研究指引 · 純度、倍體與腫瘤 DNA 比例 · Part 3 — specification of the joint estimator

下篇：聯合估計式的規格，以及它還不能宣稱什麼

把三個通道寫成單一個似然而非懲罰與似然的混合，逐層攤開由參數到計數的生成模型，處理 c 與 μ 這兩個 nuisance，並界定它解決與未解決的不可辨識性、失效模式與實作分期。

建議先修：失衡的閉式與通道

本模組學習目標

寫出聯合估計式的完整形式，並說明為何它必須是單一個似然而非懲罰項與似然的混合
逐層寫出由全域參數到觀測計數的生成模型，並指出每一層各引入哪些 nuisance 參數
說明拷貝數分段與相位定向為兩件不同的工作，以及混用兩者會扭曲哪幾個通道
界定此估計式所解決與未解決的不可辨識性，並說明加倍未定時的輸出格式
列出實作分期，並說明每一期各自可以單獨驗證什麼

為什麼重要

中篇留下的四個缺口

中篇建立了機制：單倍型失衡有閉式，其形式與上篇的等位比例式相同； somatic 掏空與拷貝數失衡是同一個分子裡的兩項，須在不同位點分別量測；而單倍型內的 somatic 佔比提供一個對另一條單倍型免疫的純度訊號。

中篇同時指出四個缺口，本頁逐一處理：

缺口	本頁處理之處
位點層級的四格表尚未產生	第二節的第四層，以及第八節第一期
$c$ 與 $μ$ 為自由參數時純度只有下界	第四節：以先驗積分掉，並回報區間
分段不能沿用 phase block	第三節：兩件不同的工作
偵測與標記誤差尚未進入似然	第二節的第四層與第六節

本頁的位階：規格，不是已驗證的方法

以下所寫的是一個可實作、可反駁的規格 —— 每一層的參數、每一個通道的分布形式、每一期可單獨驗證什麼。它尚未在任何真實或模擬資料上執行過，因此不宣稱優於現行的 DNA 比例迴歸；後者在其所針對的量上已有 MAE 0.03 的實測成績。

此處要求的判準與教材模組不同：看的不是結論是否漂亮，而是每一項假設是否寫得夠明確、足以被實測推翻。

概念與互動

一、完整的估計式

先寫出目標，其餘各節都是在拆解它。參數分三類：全樣本單一的 cellular purity $p$ ；每個拷貝數區段兩個整數 $(n_{1,} n_{2})_{s}$ ；以及每個 somatic 位點的 $(c_{i}, μ_{i})$ ，後者為 nuisance，由先驗積分掉。

\log L = \log L_{depth} + \log L_{germline} + \log L_{somatic} + \log P (CN, WGD)

四項相加，且皆為對數機率 —— 尺度一致，可比較，亦可算資訊量。第四項為簡約性先驗，對應上篇 PURPLE 的事件懲罰。

為何不能沿用上篇的分數形式

上篇的 PURPLE 分數為兩個加權平均相乘再加一個懲罰。把中篇的 somatic 通道接上去時，最直接的寫法是再加一個對數似然項 —— 但那樣寫在統計上不自洽，理由有三：

尺度無關。懲罰項隨區段數與權重增長，似然項隨變異數與深度增長，兩者之間沒有任何係數校準相對影響力。
資料組成會改變解。高突變負荷的腫瘤上，整個目標函數被 somatic 項主導；拷貝數變異密集而突變稀少的腫瘤上則相反。同一個方法在兩種腫瘤上等於兩個方法。
無法給出不確定性。懲罰不是機率，故其最小值附近的曲率不對應任何區間。

改寫為單一似然之後，簡約性偏好進入先驗而非進入分數，三個通道各為一項，相對權重由各自的分布與樣本數自動決定，不需人為係數。

左為上篇的分數：兩個平均相乘，再加一個與其無關尺度的項；三塊的高度刻意畫成隨資料組成變動。右為本頁的形式：四項皆為對數機率，相加即可，且每一項的份量由其樣本數與分布自動決定。 下方標出最實際的差別：右側的最大值附近有曲率，故給得出區間；左側沒有。

二、生成模型：從參數到計數

似然的三項各自對應一條由參數到觀測的路徑。把三條路徑攤開，即為下圖的五層 —— 每一層只做一件事，且除了第四層之外，中間沒有自由參數。

五層。第一層是全樣本唯一的純度；第二層是每個拷貝數區段的兩個整數，它們決定第三層的分子組成 —— 腫瘤細胞按其拷貝數貢獻，正常細胞每條單倍型各一份。第四層是三個觀測通道，各自從第三層抽樣，nuisance 參數全部在這一層進入： somatic 通道帶 c、μ、標記錯誤率與偵測機率。第五層是實際數到的計數。右側為導出量：倍體是第二層的加權平均， DNA 比例再由它與第一層算出。倍體與 DNA 比例都不是自由參數。

第三層：分子組成

一個區段上，每個腫瘤細胞在單倍型 1 貢獻 $n_{1}$ 份、單倍型 2 貢獻 $n_{2}$ 份；每個正常細胞各貢獻 1 份。故該區段的分子組成為：

M_{1} = p \cdot n_{1} + (1 - p), M_{2} = p \cdot n_{2} + (1 - p)

此為中篇三個通道期望值的共同來源。三個通道的差別只在於它們從這兩個量的哪一部分抽樣，以及抽樣時 somatic 等位如何切分 $M_{1}$ 。

第四層：三個通道各自的分布

通道	量測位置	分布	此處進入的 nuisance
$\log L_{depth}$	視窗全體	負二項（非卜瓦松 —— 深度有過離散）	離散度、GC 與可對應性偏差
$\log L_{germline}$	germline heterozygous 位點	beta-binomial（非二項 —— 參考偏差與標記誤差造成過離散）	參考偏差、標記錯誤率、phase switch
$\log L_{somatic}$	somatic 位點的四格表	beta-binomial，成功率為 $s_{i}$	$c_{i}$ 、 $μ_{i}$ 、標記錯誤率、偵測機率

同一條 read 上的多個位點不是獨立觀測

三個通道的分布若一律取二項，等於假設每個位點各自獨立。但長讀的一條分子會跨越多個位點，其標記錯誤與家族誤標一次作用於整條分子，使同一條 read 上的位點高度相關。

後果是有效樣本數被高估，區間因而過窄、似然比檢定過度自信 —— 而這不會在點估計上顯現。取 beta-binomial 是最低限度的處置；更完整的做法是以分子為單位建模，如中篇所述的 multinomial 形式。

第五層：四格表

中篇已指出現行的五個計數是 read 層級的標籤，不能直接相除。本層所需的是每個 somatic 位點的四格表 —— 每條覆蓋該位點的 read 同時給出「來自哪一條單倍型」與「在此位置是 REF 還是 ALT」：

read 的單倍型來源	在 $i$ 為 REF	在 $i$ 為 ALT
單倍型 1	$R_{1, ref}$	$R_{1, alt}$
單倍型 2	$R_{2, ref}$	$R_{2, alt}$

此表同時餵三件事：列和給出單倍型深度比（通道一）、第一列的內部比值給出 $s_{i}$ （通道三）、而 $R_{2, alt}$ 一格若非零，即為標記錯誤或該變異並非單一單倍型所獨有的訊號。現行實作沒有這張表，但其原料（variantsHP、tumorPosReadCorrBaseHP）已在管線裡。

三、分段與定向是兩件不同的工作

中篇曾以 phase block 的 N50 與拷貝數區段的尺度相近為由，主張可直接以 block 分段。該論證不成立：尺度相近不蘊含斷點對應。

上排為拷貝數的真實邊界，下排為相位區塊的邊界，兩者刻意畫成不對齊。中間標出兩種錯配：一個拷貝數斷點落在 block 之內（該 block 橫跨兩個狀態，其 (n₁, n₂) 不是一組整數），以及一個拷貝數狀態橫跨數個 block（相位標號在 block 之間各自獨立，故無法直接串起來）。 下方為正解：以深度與等位獨立分段並納入結構變異斷點，相位區塊只在每個區段之內提供 H1／H2 的定向。

	拷貝數分段	相位區塊
回答的問題	邊界在哪裡	邊界之內，兩條怎麼配對
依據	深度、germline 等位、結構變異斷點	germline heterozygous 位點的連鎖
混用的後果	block 橫跨兩個拷貝數狀態時， $(n_{1,} n_{2})$ 非整數，三個通道同時被扭曲

文獻補充：PURPLE 也將分段與平滑分開

PURPLE 將分段與平滑列為獨立步驟，其依據為深度、等位比例與結構變異支持，而非相位長度。此處沿用同一個分工。

四、nuisance 參數： $c$ 、 $μ$ 與兩種錯誤

中篇指出： $c_{i}$ 若為自由參數，則 $s_{i} = p \cdot c_{i}$ 對任何 $p \geq \max_{i} (s_{i})$ 皆可完美擬合，資料只給下界。本節的處置是不把它們當自由參數，也不把它們固定，而是設先驗後積分掉。

P (s_{i} ∣ p, n_{1}) = \sum_{μ_{i}} P (μ_{i} ∣ n_{1}) \int P (c_{i}) \cdot BetaBin (R_{1, alt}; R_{1, \cdot}, s_{i} (p, n_{1,} c_{i}, μ_{i}), φ) {dc}_{i}

$μ_{i}$ 為不超過 $n_{1}$ 的正整數，故其和為有限項，可直接列舉。 $c_{i}$ 的先驗取自 subclone 的階層模型：一個由 clonal 尖峰與 subclonal 連續成分構成的混合。

兩個 nuisance 參數的處置方式不同。 μ 是離散且有界的（不超過該單倍型的拷貝數），故逐一列舉； c 是連續的，故給先驗後積分。右側對照三種做法在同一批觀測上的輸出：固定 c ＝ 1 給出一個過低的點估計； c 全自由給出一條由 max(s) 起始、向上無界的平坦似然； 設先驗給出一個有峰、有寬度的後驗 —— 三者的差別不在中心位置，在於它是否給得出區間。

此處要說清楚的是先驗承擔了什麼：它並未創造資料裡沒有的資訊，而是把「腫瘤含有一批 clonal 變異」這個生物學上的常識寫成可檢驗的形式。若某個樣本實際上沒有 clonal 變異（例如極低純度導致 truncal 變異全數未被偵測），後驗會退回接近先驗，而這一點可由後驗的寬度直接看出來 —— 這正是點估計做不到的事。

五、解決與未解決的不可辨識性

解決：無等位失衡時純度不可辨識

上篇第八節列出的第一項不可辨識為「全基因體皆為 1+1 時 $ρ$ 不可辨識」。此時深度與等位比例兩條軌道皆為常數，對純度零資訊； ASCAT 將此類樣本標記為非異常並拒絕輸出，PURPLE 則轉用二倍體區段的 VAF 峰。

而此情形下 $n_{1} = 1$ 處處成立，somatic 通道仍然作用，故 $p$ 的後驗不會退化為平坦。此項不可辨識因而被解除 —— 但只是條件性的。

須同時成立的條件有四項，缺一則模型僅為部分可辨識，後驗退回第四節所述的「由 $\max_{i} (s_{i})$ 起始的下界」：

至少存在一個真正 truncal（ $c = 1$ ）的 somatic 變異；
該變異落在 $n_{1} = 1$ 的分層之內；
它被 caller 偵測到，且單倍型標記正確；
其觀測值未被抽樣雜訊推高（取極大值本身即為向上偏誤的估計量）。

四者皆非自動成立，且第三項在低純度時系統性變差（第六節第二列）。 因此輸出必須是後驗而非點估計 —— 條件不成立時，後驗的寬度會顯示出來，點估計不會。

未解決：全基因體加倍

將上篇的格點變換施於 somatic 通道： $(k, m) = (2, 0)$ 時 $n_{1} \to 2 n_{1}$ ，而發生於加倍之前的變異其 $μ$ 亦隨之加倍。代入 $s$ ：

s' = \frac{ρ' \cdot c \cdot 2 μ}{ρ' \cdot 2 n_{1} + (1 - ρ')}

以 $ρ = 0.40$ 、 $n_{1} = μ = 1$ 為例：原式 $s = 0.400$ ；加倍後 $ρ' = 0.25$ 、 $n_{1}' = 2$ 、 $μ' = 2$ ，代入仍得 $s' = 0.400$ 。

錨在加倍變換下不變，故不能單獨破解加倍簡併。 可用以定下模式的證據有三類，但三者的作用方式不同：

奇數的等位特異拷貝數 —— 只擋一個方向。它使該解無法再對半，但任何解皆可再加倍：含奇數拷貝數的解，其加倍版本全為偶數，且對深度與等位比例給出逐格相同的觀測。故奇數只是把該解定為此族中最小的一個；真正排除加倍解的是簡約先驗，不是資料。
加倍之後才發生的變異 —— 這一項才是資料證據。其 $μ$ 不隨拷貝數加倍，故兩個模式對它預測不同的 $s$ 。惟須另行判定該變異的發生時序。
樣本外的量測：流式細胞術的 DNA 指數、核型或 FISH。

三種不可辨識的處置對照。左欄「全基因體無等位失衡」：兩條軌道皆為常數，但 n₁ = 1 處處成立，故錨仍給出純度 —— 解除。中欄「錨的區域限制」：

s

的分母不含另一條單倍型，故 LOH 與擴增區段皆可用 —— 解除。右欄「全基因體加倍」：拷貝數與 multiplicity 一同加倍時

s

不變 —— 仍未解除，須另以簡約先驗或樣本外量測處理。

輸出格式：加倍未定時保留兩個模式

上述三類證據皆不成立時，後驗為雙峰。此時回報單一組 $(p, κ)$ 會把一個雙峰的後驗壓成一個看似確定的數字，且兩個峰所對應的 $κ$ 相差一倍 —— 這在臨床解讀上不是小差異。

同一份資料的後驗。左為雙峰的實況：兩個模式的 (p, κ) 分別為 (0.40, 2.0) 與 (0.25, 4.0)，兩者對深度與等位比例給出相同的期望值。中為「取最高峰回報一個數」的結果：另一個模式連同它的機率一併消失。右為本頁要求的輸出：兩個模式各自附機率，並列出可用以定案的三類證據及其在本樣本上的狀態。

六、失效模式

失效	機制	處置
`H3` 與無 germline 錨的位點	無法歸屬單倍型的 somatic read 進不了四格表。原始文獻報告 `H3` 的 F1 為 0.746、recall 僅 0.596	單倍型繼承程序可救回一部分；救不回者應排除該位點，不得計為零
低 DNA 比例時的 recall 下降	somatic 標籤的 recall 在比例 0.2 時降至約 0.6，使 $R_{1, alt}$ 被系統性低估， $p$ 隨之低估	偵測機率須進入第四層的似然，並以有真值的資料集估計其對 VAF 與深度的依賴
取樣偏誤	somatic 位點由 caller 挑選，其靈敏度隨 VAF、深度、序列脈絡、平台與純度而變，故納入模型的位點不是隨機樣本，而是偏向高 VAF 者	與上一列為同一組參數；僅把 `H3` 排除並不足夠，因為其缺失亦非隨機
subclonality	$s = p \cdot c$ ，單一位點分不開 $p$ 與 $c$	第四節的先驗；並回報 $s$ 的多峰結構，其本身即為 subclone 的訊號
標記錯誤與參考偏差	phase switch、reference bias 與 mapping bias 皆壓縮或扭曲等位失衡	分支專屬的靈敏度與偽陽性參數； $R_{2, alt}$ 一格提供其就地估計
跨 phase block	H1／H2 的標號逐 block 獨立（M13 的重要區分 #13），故 $(n_{1,} n_{2})$ 的配對只在單一 block 內有定義	$κ$ 不受影響（僅用 $n_{1} + n_{2}$ ）；沿染色體的等位特異拷貝數軌道需跨 block 連結，此為硬上限
TINC	正常樣本內含腫瘤時，正常側的深度正規化與濾波門檻皆偏移	現行的正常樣本 VAF 門檻處理其一；對本模型的影響須另行評估

哪些 somatic 位點無法貢獻四格表的第一列。上排為可用者：該位點附近有 germline heterozygous 位點，且 read 同時覆蓋兩者。下排為三類不可用者：附近無 germline 錨、read 過短無法同時覆蓋、以及位於 phase block 邊界。三者皆使 read 落入 H3。 這些位點不得計入分母而以零充數 —— 那會使純度被系統性低估。

七、與現行方法的對照

與現行迴歸：同一條資料路線之內

項目	現行：兩個矩加多項式迴歸	本頁的規格
輸出	$f$ 一個純量	$p$ 、 $κ$ 、每段 $(n_{1,} n_{2})$ ， $f$ 為導出量
係數來源	由合成混合樣本擬合而得	不需純度迴歸的監督式訓練；式中的量皆有物理意義。惟偵測機率、標記錯誤率與平台校準參數仍須估計
跨平台	ONT 訓練、PacBio 直接轉移（原始文獻已驗證可行）	不含平台特定的迴歸係數；惟錯誤率、標記正確率與偵測機率仍須逐平台校準 —— 「不需訓練係數」不等於「平台無關」
深度依賴	折疊偏移進入兩個特徵，故隱含於係數之中	折疊可顯式建模為二項分布
不確定性	無	後驗給出區間；加倍未定時給出兩個模式
拷貝數變異與 LOH	視為干擾，以「經驗上穩健」處理	顯式建模，成為輸出的一部分
已驗證程度	8 個 ONT 與 6 個 PacBio 資料集，MAE 0.03	尚未執行

末列是本頁最重要的一列。上表前六列是設計目標，不是已達成的狀態；現行迴歸在 $f$ 上的成績已相當好，本規格在該項上不見得更好，且多出的參數會帶來額外的估計誤差。

可宣稱的論據限於三項：把兩種成因分開量測、多輸出三個量、以及失效模式可診斷；不可宣稱精度改善。

與 ASCAT／PURPLE：真正的對照基準

現行迴歸不是唯一的比較對象，甚至不是最重要的那一個。上篇所述的 ASCAT 與 PURPLE 是這個問題的既有標準，而本規格的三個通道有兩個與它們重疊 —— 總深度與等位比例 —— 所用的代數也是同一套。因此差異必須逐項指出，不能以「資料型態不同」帶過。

項目	ASCAT	PURPLE	本頁規格
等位訊號	germline heterozygous 位點的 BAF，刻意不做相位，A／B 標號隨機化，軌道對稱於 0.5	AMBER 取兩者較大值，值域 $[0.5, 1]$	覆蓋該位點的 read 已帶單倍型標籤，故 phase block 之內不需折疊
折疊偏移	逐位點折疊後再分段	以二項分布算出平衡區段的期望值，觀測低於 0.535 時比較兩種解釋	折疊前的聚合單位由一個位點放大為一個 phase block，偏移隨區塊內總計數下降
somatic 通道	不使用	兩用：低純度解的懲罰，以及高度二倍體樣本的 VAF 退路（限推得拷貝數 1.8–2.2）	與另兩者同級的似然項；統計量為 $s$ ，分母不含 $n_{2}$ ，故不需該區域限制
分段	等位特異的分段（ASPCF），深度與等位聯合	深度、等位與結構變異斷點	同 PURPLE 的三項依據 —— 此為沿用，不是新增
加倍簡併的處置	硬性倍體界限；四道條件皆不通過即回傳 `NA`	連續的事件懲罰，加上一條來自 somatic 的約束	不選解：兩個模式各自附機率一併輸出
不確定性	點估計，或 `NA`	已輸出 `minPurity`／`maxPurity`（來自分數曲面）	後驗區間。差別不在「有沒有」，而在它是似然而非分數，因而可回報多峰
subclonality	嚴格 clonal	允許非整數拷貝數，但擬合中無混合模型	$c$ 顯式建模並給先驗； $s$ 的多峰結構本身即訊號
輸入需求	陣列或短讀；標準用法為配對正常樣本	短讀全基因體；另有 tumor-only 模式	長讀，且需可用的相位區塊 —— 短讀資料上不適用
已驗證程度	原始文獻 79 例，其後為泛癌標準工具	逾兩千例轉移性全基因體隊列	尚未執行

每一列是一個可由資料算出的統計量，每一欄是一個方法。填色為使用、虛線為不使用、橘框為有條件使用。重疊的部分比預期多：總深度、逐位點折疊的等位比例與結構變異斷點， ASCAT 或 PURPLE 至少有一個已經在用。只有第三列（相位後不折疊的單倍型深度比）與第六列（分母只涵蓋一條的

s

）是新增的。現行迴歸的 GHIR 自成一列 —— 它量在 somatic 位點上，但分母涵蓋兩條且經過折疊，故與新增的兩者皆不同。

三項可宣稱的新意，與三項不是新意的事

上表的重疊處提示了一件事：把「換一種資料重做同一件事」講成「解決了別人解不了的問題」，是最容易犯的錯。以下逐項界定。

① 相位由分子本身給出。 ASCAT 與 PURPLE 的等位軌道都是折疊的，其代價已在中篇量化：深度 20 時折疊偏移為 0.088，大於 $p = 0.20$ 二倍體位點的整段訊號 0.056。須註明的是兩者對此的處置並不相同：PURPLE 以二項分布明確校正（0.535 的比較），ASCAT 則無此步驟。單倍型標籤使折疊前的聚合單位由一個位點放大為一個 phase block，偏移隨區塊內的總計數而非單位點深度下降。
邊界：這是量的改變，不是質的消除。區塊之間的 H1／H2 標號仍然任意（第六節），跨區塊連結是未解問題；而相位輔助的等位失衡估計本身並不新 —— Battenberg 早以參考面板 imputation 達成同一方向的效果。

② germline 錨與 somatic 位點落在同一條分子上。 這是短讀與陣列做不到的一件事，也是三項之中唯一長讀獨有者：參考面板可以把 germline 位點相位化，但 somatic 變異不在任何面板裡，面板 imputation 因此推不出四格表。四格表使 somatic 通道的統計量由 VAF（分母兩條單倍型）變為 $s$ （分母一條），PURPLE 的拷貝數 1.8–2.2 區域限制隨之不再需要。
邊界： $s$ 只消去 $n_{2}$ ，仍依賴 $n_{1}$ 、 $c$ 與 $μ$ （中篇第五節）；且它取代的是 PURPLE 的退路，不是其主要擬合。

③ 三個通道進同一個似然，共用一個 $p$ 。 PURPLE 的 somatic 輸入是懲罰項與退路，不是帶自身抽樣模型的似然項；本規格把它升格為與另兩者同級的一項。
邊界：「有不確定性」不是新的 —— PURPLE 已輸出 minPurity／maxPurity。新的是它是似然而非分數，因而可回報多峰而非單一區間；而此優點以模型正確為前提，模型錯時區間會過窄。

左為三項新增，每項附其邊界；右為三項既有技術及其出處。把右欄寫出來的理由是：純度與倍體的聯合網格擬合、somatic 變異當純度錨、相位輔助的等位失衡估計，三者都已有人做過。底列為結論 —— 只有第二項是長讀獨有的。

不可宣稱「取代 ASCAT／PURPLE」

三項限制同時成立：其一，本規格需要長讀與可用的相位區塊，在短讀與陣列資料上不適用，故它不是同一個生態位的替代品；其二，它尚未執行任何驗證，而對照的兩者各有 79 例與逾兩千例的紀錄；其三，上表九列之中，資訊上真正新增的只有兩個統計量，其餘皆為既有技術的重新組合。

可宣稱的是一句範圍明確的話：在長讀資料上，somatic 錨不再受拷貝數區域限制，且輸出多一組 $(n_{1,} n_{2})$ 軌道與一組區間。 中篇的警告在此同樣適用 —— LOH 對 ASCAT 與 PURPLE 的主要擬合並非不利，不可宣稱「在它們失效之處仍然可用」。

八、實作分期

四個缺口彼此有依賴關係，故順序不是任意的。在四格表建起來之前擬合整個模型，殘差無法歸因；在無雜訊式子未經模擬驗證之前談效能，量到的是實作錯誤而非方法極限。

期	內容	此期可單獨驗證什麼
一	位點層級四格表；以深度與等位獨立分段（納入結構變異斷點）	計數正確性。不涉及任何模型選擇，可與既有 caller 的 VAF 逐位點對帳
二	以模擬計數反解無雜訊式子	實作錯誤。由已知的 $(p, n_{1,} n_{2,} c, μ)$ 生成計數，確認可反解回原值；此期失敗與方法無關
三	階層式似然：三個通道加 $c$ 、 $μ$ 、標記錯誤與偵測機率的先驗	收斂性與初始值敏感度；後驗區間的涵蓋率
四	加倍未定時輸出多個模式	模式判定的正確率
五	掃參數空間的模擬：純度、倍體、加倍時序、subclonal 拷貝數變異、突變負荷、phase switch 錯誤率、深度、讀長、TINC、兩個平台	失效邊界的位置

完整流程。淺色的四步為現行實作已具備者：單倍型標記、五個計數、低信心變異濾除，以及提供區段內定向的 phase block。深色的四步為新增者：以深度與等位獨立分段、位點層級四格表、依 n₁ 分層的聯合最佳化，以及輸出四個量與其區間。 現行的「兩個矩加迴歸」被整段取代。

真實資料與證據

真值缺口

合成混合樣本依 read 比例混合，其所控制的量是分子比例 $f$ 。本規格的主要輸出為 $p$ 與 $κ$ ，而這兩者在此資料上沒有乾淨的真值。

由 $f$ 反推 $p$ 需要來源細胞株的倍體。以標示為 0.2 的混合樣本為例：

來源細胞株的 $κ$	2.0	3.2	4.0
$f = 0.20$ 所對應的 $p$	0.200	0.135	0.111

重要區分 #18：合成混合的已知比例是 DNA 比例，不是細胞比例

以 read 抽樣後合併所合成的樣本，其已知的比例是分子的比例 $f$ 。 M8 已建立 $f$ 與 cellular purity $p$ 在非二倍體之下並不相等（重要區分 #2）；此處是該項在實驗設計上的後果。

可容許之處：以此資料評比一個輸出 $f$ 的方法完全恰當，真值精確且無須換算。現行的評比即屬此類。

限制：以同一批資料評比一個輸出 $p$ 的方法時，須先將標示值換算為 $p$ ，而該換算需要來源細胞株的倍體。若逕以標示的 0.2 當作 $p$ 的真值，會改變方法之間的排名 —— 誤差是到參考值的距離，換掉參考值不是對所有估計值施加同一個平移，故估得偏高、恰好接近 $f$ 的方法會被系統性地評為較佳。

三條分開的評比軌道

因此驗證設計不能只有一張表。三個量的真值強度不同，須分開報告：

三條軌道各有不同的真值來源與可宣稱的強度。左：f 有精確真值（混合比例即為之），可與現行迴歸直接比較， 這是唯一能宣稱「優於現行方法」的軌道。中：p 與 κ 沒有乾淨真值，只能與另有佐證的樣本比對，或檢驗自洽性 —— 由估得的兩者換算回 f，與已知混合比例對照。右：校準度（區間涵蓋率、失敗率、加倍模式正確率）完全不在 MAE 與 R² 的涵蓋範圍內，但它才是「這個數字可不可以拿去用」的依據。

軌道	真值來源	可宣稱什麼
$f$	混合比例，精確	與現行迴歸的直接比較
$(p, κ)$	流式細胞術、DNA 指數、核型或 FISH；皆須另行取得且帶不確定性	僅能宣稱一致性，不能宣稱準確度
校準度	不需外部真值	區間涵蓋率、失敗率、加倍模式正確率

第三條軌道不需要金標準，而金標準正是此主題最欠缺的條件。同一細胞株在不同 basecaller、不同機構之間的重現性亦屬此類。

預測與結果檢視

一份合成混合樣本標示為「purity 0.2」，其來源細胞株的倍體為 3.2。某方法在此樣本上估得 cellular purity 為 0.14，另一方法估得 0.18。哪一個比較準？

展開答案

0.14，而且用錯參考值會得到相反的答案。

該樣本以 read 比例合成，故標示的 0.2 是分子比例 $f$ 。對應的 cellular purity 為

p = \frac{2 f}{κ (1 - f) + 2 f} = \frac{2 \times 0.20}{3.2 \times 0.80 + 0.40} = 0.135

估計值	對真值 $p = 0.135$ 的誤差	對標示值 $0.20$ 的誤差
0.14	0.005（較佳）	0.060
0.18	0.045	0.020（較佳）

排名反轉。常見的誤解是「這個偏誤作用於所有受測方法，故排名不受影響」—— 該說法不成立，因為誤差是到參考值的距離，換掉參考值並非對所有估計值施加同一個平移。

其方向亦值得留意：用錯參考值的評比會系統性地偏好那些估得偏高、恰好接近 $f$ 的方法 —— 也就是偏好把 DNA 比例當純度回報的方法。此偏誤不會在任何內部一致性檢查中顯現。

尚未解決的問題

整條規格尚未執行。上述各項皆有代數上的依據，但均未在真實或模擬資料上檢驗。最小的驗證為第八節第二期：由已知參數生成計數，確認可反解回原值。
分層與估計互為前提。 $s$ 的分層需要可靠的每段 $(n_{1,} n_{2})$ ，而後者正是要一併估計的量。此為典型的交替最佳化問題，其收斂性與初始值敏感度未知。
偵測機率的形式未定。它至少依賴 VAF、深度與序列脈絡，但其函數形式須由有真值的資料集估計，而該資料集目前僅有 HCC1395 一株。
$c_{i}$ 先驗的來源。本頁取自 subclone 的階層模型，而該模型在本教材的另一個主題中本身也是待建立的對象；兩處若各自選定不同的先驗，得到的 $p$ 會不一致。
$p$ 與 $κ$ 沒有乾淨的真值。三條軌道皆為間接，且此條件不因方法改良而改善。
與 subclone 重建共用 $c$ 。兩處的估計理應一致，目前各自獨立、未曾互相檢驗 —— 而互相檢驗本身即為一項不需金標準的驗證。

原始文獻與程式碼

本頁的計數定義與各項閉式，均以 LongPhase-S 的原始碼為準： GHIR 的定義見 src/haplotag/HaplotagStrategy.h 的 calculateHaplotypeImbalanceRatio；五個計數與其填入條件（含 hpResult 為 read 層級標籤一事）見 src/somatic_haplotag/SomaticVarCaller.cpp；低信心變異濾波與現行的迴歸流程見 src/somatic_haplotag/TumorPurityEstimator.cpp。程式碼在 github.com/CCU-Bioinformatics-Lab/longphase-s，方法與實測數值見其預印本（bioRxiv, 2025，doi 10.1101/2025.11.20.689492）。

第一節的似然形式、第三節的分段分工與第五節的格點變換，其出處、常數與程式碼位置均列於上篇的同名節次，此處不重複。負二項與 beta-binomial 在定序計數上的適用性為標準結果，可見於任何一本計數資料迴歸的教科書。

本模組術語

TINC（腫瘤污染正常樣本）: Tumour-in-normal contamination：配對正常樣本含有腫瘤來源訊號，使 genuine somatic 變異也可能在 normal 中被觀察到，因而可能被錯誤過濾。
phase block: 一段可建立連續相位關係的區域。read 長度不足、缺少 informative heterozygous 位點或證據不一致時，可能形成不同 phase blocks。