中篇：單倍型失衡的閉式與三個觀測通道

為什麼重要

先把現行流程估的量講清楚

M12 已完整教過 LongPhase-S 的四個階段。此處只需要第二階段的一句話摘要： 把全基因體的 GHIRGHIR 生殖系單倍型失衡比Germline Haplotype Imbalance Ratio：在候選 somatic 位點上，取標為 HP1 與 HP2 的 read 數中較大者除以兩者之和，值域為 0.5 至 1。須注意兩件事：分母只含這兩個 germline 計數，HP1-1／HP2-1／HP3 皆不在內；且這些標籤是整條 read 的判定（該 read 任一處帶 somatic 等位即離開 germline 計數），並非該位點的等位計數。它不是直接的 purity 讀數：拷貝數變異、LOH、read 跨距內的突變密度、標記錯誤與抽樣不足都會使它偏移。Germline Haplotype Imbalance Ratio: at a candidate somatic locus, the larger of the HP1 and HP2 tagged read counts divided by their sum, ranging from 0.5 to 1. Two caveats: the denominator contains only those two germline counts, excluding HP1-1/HP2-1/HP3; and those tags are whole-read decisions (a read carrying a somatic allele anywhere leaves the germline counts), not per-locus allele counts. It is not a direct purity readout — copy number, LOH, mutation density within the read span, tagging error and sparse sampling all shift it.完整條目 → 分布收成中位數與四分位距兩個數字， 再以一條二次多項式迴歸換成一個純量。

那個純量是腫瘤 DNA 比例tumour DNA fraction 腫瘤 DNA 比例樣本 DNA 中源自腫瘤的比例。與 tumor purity（細胞比例）在 aneuploid 或 WGD 的情況下會不一樣。The fraction of DNA originating from tumour cells; diverges from cellular purity under aneuploidy or WGD.完整條目 → $f$， 不是 cellular puritytumour purity 腫瘤純度樣本中腫瘤細胞所佔的比例。purity 越低，somatic 訊號被正常細胞稀釋得越嚴重，偵測越困難。The fraction of cells in a sample that are tumour cells. Low purity dilutes somatic signal.完整條目 → $p$。理由不在實作，在模型形式：

兩者相合的結論是：現行流程在原理上就不可能輸出 $p$。 子指令名為 estimate_purity、輸出欄位寫 Tumor purity:， 是命名與量不一致，不是模型少估了一個數（M12 的重要區分 #21）。

此點須先講，因為它決定了本頁後續每一句話的位階： 現行迴歸在 $f$ 上的實測成績（MAE 0.03）成立且不受此影響； 本頁與下篇要換掉的不是它的準確度，而是它的輸出集合。

現行迴歸的四項限制

除了輸出集合之外，這條迴歸另有三項可由代數直接看出的限制。 四項並列如下，每一項在本頁的哪一節導出亦一併列出：

四項的性質不同，值得分開看。第一項是不可能（模型形式所決定）， 第三、四項是可檢驗的混淆（兩者皆不需要新資料即可驗證）， 第二項則是可辨識性問題 —— 它不隨資料量改善，只能靠改變量測方式解決。 第二項也正是接下來三節的出發點。

上篇留下的限制

上篇的結論為：深度與等位比例所決定的是一個格點族， 族內選點須依賴錨或偏好，而同一份資料之內最強的錨是 somatic 變異的 VAF。 該錨的限制亦已指出 —— 其關係式 $\mathrm{VAF}=p/2$ 的分母含兩條單倍型的拷貝數， 故僅在二倍體區段成立。PURPLE 因此將此估計限於推得拷貝數落於 1.8 至 2.2、 且較小等位不低於 0.5 的區域。

腫瘤基因體上符合該條件的區域往往不是多數， 而不符合的區域（LOH、單一等位擴增、非整倍體）恰是腫瘤最具資訊的部分。 錨最有力之處，正是它被排除之處。

單倍型標記改變了分母

當 read 已帶有單倍型標記時，同一個 somatic 訊號可以在單一條單倍型之內計數： 分子為該單倍型上帶有 somatic 等位的分子數，分母為該單倍型的全部分子數。 另一條單倍型完全不進入這個比值，前述的限制隨之消失。

本頁的內容即為此一觀察的展開，順序與上面那張表一致： 先由原始碼寫出現行統計量的閉式，把四項限制逐一導出來（第一至三節）； 再據以勾勒一個可同時輸出 cellular purity 與 ploidy 的估計式（第四、五節）， 使 tumour DNA fraction 由 $p$ 與 $\kappa$ 導出，而非由一條擬合曲線直接給出。

現行實作已有的原料，以及還缺的一格

現行實作在每個 somatic 位點上，已將覆蓋該位點的 read 依標籤分入 H1、H2、H1-1、H2-1、H3 五個計數 （SomaticVarCaller.cpp 的 ReadHpCount）， 並已算出三個比值：germlineHaplotypeImbalanceRatio（即 GHIRGHIR 生殖系單倍型失衡比Germline Haplotype Imbalance Ratio：在候選 somatic 位點上，取標為 HP1 與 HP2 的 read 數中較大者除以兩者之和，值域為 0.5 至 1。須注意兩件事：分母只含這兩個 germline 計數，HP1-1／HP2-1／HP3 皆不在內；且這些標籤是整條 read 的判定（該 read 任一處帶 somatic 等位即離開 germline 計數），並非該位點的等位計數。它不是直接的 purity 讀數：拷貝數變異、LOH、read 跨距內的突變密度、標記錯誤與抽樣不足都會使它偏移。Germline Haplotype Imbalance Ratio: at a candidate somatic locus, the larger of the HP1 and HP2 tagged read counts divided by their sum, ranging from 0.5 to 1. Two caveats: the denominator contains only those two germline counts, excluding HP1-1/HP2-1/HP3; and those tags are whole-read decisions (a read carrying a somatic allele anywhere leaves the germline counts), not per-locus allele counts. It is not a direct purity readout — copy number, LOH, mutation density within the read span, tagging error and sparse sampling all shift it.完整條目 →）、 allelicImbalanceRatio 與 somaticHaplotypeImbalanceRatio。

但這五個計數是read 層級的標籤（見第一節的說明框）， 不是位點層級的等位計數，因此不能直接相除當作任何單一位點的等位比例。 下文所需的三個觀測通道之中，只有總深度比可由現有輸出直接取得； 單倍型深度比需在 germline heterozygous 位點上另行彙總， 而單倍型內 somatic 佔比需要一張目前尚未產生的位點層級四格表。

可容許的說法是：原料（每條 read 的單倍型歸屬與逐位點等位）已經在管線裡 （variantsHP、tumorPosReadCorrBaseHP）， 缺的是彙總方式與模型；不可說成「只要把既有的兩個數字相除」。

本頁討論範圍限於單一樣本的 cellular purity、ploidy 與等位特異拷貝數； subclonality 僅作為混淆項出現，其重建屬另一主題。

概念與互動

一、GHIR 的定義，以原始碼為準

帶有 somatic 等位的 read 不會落入 H1 或 H2。 標記程序先判定該 read 是否帶有 somatic 等位（tumorMaxHPcount != 0）， 帶有者才進入 H1-1／H2-1／H3 的分支； 兩個 germline 計數僅收未帶 somatic 等位的 read。

二、理想化焦點統計量的無雜訊值

三個計數的分子數

本節先處理一個理想化的量：假設該 read 跨距之內 只有焦點這一個 somatic 變異。此假設使「這條 read 帶不帶 somatic 等位」 等同於「它在焦點位點帶不帶 ALT」，五個計數因而可以直接寫成焦點位點的函數。 下一小節說明放掉此假設之後會變成什麼。

設 somatic 變異位於 germline 單倍型 1。令 $p$ 為 cellular purity、 $n_1$ 與 $n_2$ 為該處腫瘤細胞的等位特異拷貝數、 $c$ 為帶有此變異的腫瘤細胞比例、$\mu$ 為 multiplicity。 正常細胞在兩條單倍型上各一份。各計數所對應的分子數為：

此式與上篇的等位比例式為同一個形式。 將上篇的 $n_B$ 代換為 $n_1-c\mu$、總拷貝數代換為 $n_1+n_2-c\mu$， 兩式逐項對應。差別僅在兩處：分子外多一層 $\max$（折疊）， 以及腫瘤側的拷貝數被 somatic 的 $c\mu$ 扣掉一塊。

二倍體、clonal、multiplicity 為 1 的特例

代入 $n_1=n_2=1$、$c=1$、$\mu =1$： H1 為 $1-p$，H2 為 $1$，故

式中的 $p$ 是 cellular purity，而迴歸的標籤是 DNA 比例

上式須逐字讀：${\mathrm{GHIR}}^{\infty }=1/(2-p)$ 的自變數是 $p$， 即該位點所在處細胞的腫瘤佔比。它之所以是細胞比例而非分子比例， 可由第二小節的三行計數直接看出 —— 每個正常細胞在兩條單倍型上各貢獻一份， 每個腫瘤細胞按其 $n_1$、$n_2$ 貢獻。分母裡沒有任何一項是 $f$。

而迴歸擬合的標籤是 $f$（上篇第三節）。 兩者不是同一個量，也不是同一個層級：$p$ 逐位點成立、$f$ 是全基因體的單一數。 以來源細胞株的倍體 $\kappa$ 為變數，看同一個 $1+1$ 位點在各混合樣本上實際給出什麼：

末列的跨度為 0.078。此量值得與本節與下一節的另外兩個數並排： 突變負荷 50／Mb 所造成的位移為 0.089，深度 20 時的折疊偏移為 0.088。 三者同一個數量級，且皆非模型的自由參數。

此表只變動一個變數，故須說明其人工之處：一個 $\kappa =4$ 的基因體上， $1+1$ 的區段本來就不是多數，其餘區段的 GHIR 另有偏移 —— 那正是本節末的第二項限制。 表的用途不是預測某個樣本的 GHIR，而是證明標籤與自變數不是同一個量。

迴歸仍能在同一批細胞株上取得 MAE 0.03，並不與此矛盾： 給定 $\kappa$ 之後 $f$ 與 $p$ 單調相關，故一條擬合曲線可以同時吸收 「$p$ 到 GHIR」與「$f$ 到 $p$」兩段關係。 代價是所得的係數裡含有該訓練面板的倍體組成，而該組成不是模型的參數， 也不隨新樣本更新。

放掉理想化假設之後：實際的 GHIR 還依賴突變負荷

第一節已指出 hpResult 是整條 read 的標籤。 因此一條 read 只要在跨距內任何一處帶有 somatic 等位，就會離開 germline 計數 —— 與它在焦點位點是不是 ALT 無關。上式因而不是實際 GHIR 的閉式。

令 $\lambda$ 為一條 read 的跨距內其他可偵測 somatic 變異的期望數。 二倍體、clonal、焦點變異位於單倍型 1 時：單倍型 1 的腫瘤分子全部帶有焦點變異， 故 H1 只剩正常細胞；而單倍型 2 的腫瘤分子亦被其他變異掏空：

末欄與理想化的 0.667 相差 0.089，大於低純度區間的整段訊號 （$p$ 由 0 到 0.2 時 GHIR 只由 0.500 走到 0.556）。

因此本節的結論須分兩句陳述： 理想化的焦點統計量在二倍體 clonal 之下為一條已知的一元函數； 而現行的 GHIR 不是該函數，它另外依賴 read 跨距、突變負荷、偵測率與 clonality。 第五節所建立的焦點四格表即為取回前者的方式。

兩種歸因是同一條式子的兩項

GHIR 的偏移可歸因於 somatic read 的過度呈現， 亦可歸因於拷貝數變異、LOH 與非整倍體所造成的等位失衡。 上式顯示兩者是同一個分子裡的兩項： $c\mu$ 一項為 somatic 所造成的掏空，$n_1\ne n_2$ 一項為拷貝數所造成的失衡。 二倍體時只剩前者；有拷貝數變異時兩者相加。

而單一個 GHIR 值無法分開兩者。 $p=0.50$ 時，二倍體 clonal 的位點給出 $\mathrm{GHIR}=0.667$； 而一個該處無 somatic 變異、但等位特異拷貝數為 $1+3$ 的位點， 其 GHIR 同樣為 $0.667$。這正是 單倍型失衡haplotype imbalance 單倍型失衡指派至兩條親源單倍型的 read 數不相等。其成因有二：該處兩條單倍型的拷貝數不同，或其中一條的分子被改標至 somatic 子單倍型。兩者在數值上形式相同，僅憑一個失衡值無法區分。Unequal read counts assigned to the two parental haplotypes. Two mechanisms produce it: unequal allele-specific copy number, or molecules of one haplotype being relabelled to a somatic sub-haplotype. The two are indistinguishable from a single imbalance value.完整條目 → 一詞所涵蓋的兩種成因。

三、折疊效應：為何上式不是期望值

上一節的式子是把期望分子數代入比值所得， 即 $\max \left(E\right[H1],E[H2\left]\right)/\left(E\right[H1]+E[H2\left]\right)$。 由於 $\max$ 為非線性函數，它不等於比值的期望值 $E\left[\max \right(H\mathrm{1,}H2)/(H1+H2\left)\right]$。兩者的差距在低深度下並不小： $p=0.20$、跨越深度 20 時，前者為 $0.556$，後者為 $0.599$。 故上式應稱為無雜訊值或漸近值，不可稱為期望值 —— 任何以它反解純度的做法，在有限深度下都帶有系統性偏誤。

$\max$ 使 GHIR 恆不小於 0.5，因此即使真實情形完全平衡 （$n_1=n_2$ 且無 somatic 變異），有限深度下的樣本 GHIR 期望值仍高於 0.5。 其偏移量隨跨越深度下降而增大：

此表的數值可與訊號本身相比：$p=0.20$ 的二倍體位點， 其無雜訊值為 0.556，訊號量為 0.056。而深度 20 時的折疊偏移為 0.088，大於該訊號。 在低純度區間，折疊所造成的位移可以超過純度所造成的位移。

四、三個觀測通道

要把 $p$、$n_1$、$n_2$、$c$ 與 $\mu$ 分開， 須在不同位點分別量測，而非壓在單一個統計量上。 已標記的 read 提供三個通道：

此處的關鍵區分在於量測位置。GHIR 量在 somatic 位點上， 故其分子同時混入 $c\mu$ 與 $n_1-n_2$； 而第一個通道量在 germline heterozygous 位點上，該處無 somatic 掏空， 所以只承載拷貝數。兩者分開量測，前一節所述的兩項即分離。

現行流程並未使用第一個通道 —— 它把等位失衡與 somatic 掏空 壓在同一個 GHIR 上，再以分布的兩個矩概括之。

五、單倍型內的 somatic 佔比

先把計數定義清楚

承第一節的警告：現行的五個計數是 read 層級的標籤，不能直接相除。 此處所需的是位點 $i$ 的四格表 —— 每條覆蓋 $i$ 的 read 同時給出兩件事：它來自哪一條單倍型，以及它在 $i$ 這個位置是 REF 還是 ALT。

$n_1=\mu =1$ 且 $c=1$ 時 $s=p$

代入即得 $s=p·1/(p+1-p)=p$。 與上篇 PURPLE 所用的 $\mathrm{VAF}=p/2$ 相比，此處沒有那個 2。 成因在分母：$\mathrm{VAF}$ 的分母涵蓋兩條單倍型，故正常細胞貢獻 2 份； $s$ 的分母只涵蓋一條，正常細胞只貢獻 1 份。

式中不含 $n_2$

這是此路線的主要論據，但其範圍須精確界定。 $s$ 消去的只有 $n_2$；它仍直接依賴帶有變異的那一條單倍型的拷貝數 $n_1$， 以及 $c$ 與 $\mu$。

因此正確的說法是「侷限於另一條單倍型的變化不影響它」， 而非「LOH、擴增與非整倍體皆不影響它」。落在帶有變異那一條上的事件全部有影響： copy-neutral LOH、該條的擴增、變異發生於擴增之前或之後（決定 $\mu$）， 以及該條本身被刪除（此時 $s$ 無定義）。 以 $p=0.50$、$n_1=1$ 固定、僅改變 $n_2$ 為例：

PURPLE 之所以將 somatic 擬合限於推得拷貝數 1.8 至 2.2 的區域，理由即在第二、三列： 在該範圍之外，$2\times \mathrm{VAF}$ 的偏誤達三成。$s$ 不需要這道限制。

此亦為 LongPhase-S 原始文獻中一項假說的機制。 該文推測其估計在 LOH 與非整倍體之下仍穩健，係源於 phase-aware 的估計方式， 但未給出機制。上式即為該機制：分母限於單一條單倍型，另一條的拷貝數因而消去。

LOH 區段：錨與深度訊號同時最強

梳齒：$s$ 在各 $\left(n_{\mathrm{1,}}\mu \right)$ 之下取離散值

$s=p$ 僅在 $n_1=\mu =1$ 且 $c=1$ 時成立。 一般情形下，由於 $\mu$ 為不超過 $n_1$ 的正整數， $s$ 的可能值構成一組離散的位置 —— 以 $p=0.50$ 為例：

$c<1$ 時 $s$ 由該齒向下移動，故每一齒實為一個上界。 表中 $\left(\mathrm{1,}1\right)$ 與 $\left(\mathrm{3,}2\right)$ 給出相同的值，說明盲目地在 $s$ 的分布上找峰並不可行。

可行的做法是先分層：$n_1$ 由第一、二通道就地取得， 故各位點可依其所在區段的 $n_1$ 分組，組內的齒位是已知的有限集合。 在 $n_1=1$ 的組內 $\mu$ 只能為 1，故 $s=p·c$。

六、接下篇

以上建立的是可以量到什麼：三個通道各自量在哪些位點上、 各自承載哪些參數，以及單倍型內的 somatic 佔比為何對另一條單倍型免疫。

尚未回答的是怎麼把三者合成一個估計式。 下篇處理該問題，並逐一補上本頁指出的四個缺口： 位點層級的四格表、$c$ 與 $\mu$ 的處置、 拷貝數分段與相位定向的分工，以及偵測與標記誤差如何進入似然。

下篇同時界定此規格未能解決的部分 —— 全基因體加倍仍不可辨識 —— 並給出加倍未定時的輸出格式與實作分期。

回到本頁開頭的四項限制，可以說清楚下篇要換掉的是哪一項。 第三、四項（折疊偏移、突變負荷）是可檢驗的混淆，兩者都不需要新資料就能量出來； 第二項（兩種成因壓在同一個數上）由本頁的第四、五節解決 —— 分開量測位置即可。 而第一項是唯一非改模型不可的：$p$ 與 $\kappa$ 要成為輸出， 就必須有參數代表它們，也必須有一個能同時擬合三個通道的似然。下篇處理的正是這件事。

真實資料與證據

原料的現況

下列數值皆出自 LongPhase-S 的原始文獻與其原始碼， 在本頁的脈絡下構成可用原料的清單。

預測與結果檢視

原始文獻與程式碼

本頁的計數定義與閉式，均以 LongPhase-S 的原始碼為準： GHIR 的定義見 src/haplotag/HaplotagStrategy.h 的 calculateHaplotypeImbalanceRatio； 五個計數與其填入條件見 src/somatic_haplotag/SomaticVarCaller.cpp， 其中 hpResult 每條 read 只計算一次，再記入該 read 覆蓋的每一個 somatic 位點。 程式碼在 github.com/CCU-Bioinformatics-Lab/longphase-s， 方法與實測數值見其預印本 （bioRxiv, 2025，doi 10.1101/2025.11.20.689492）。

前身工具見 Lin J-H et al., LongPhase: an ultra-fast chromosome-scale phasing algorithm for small and large variants, Bioinformatics 2022;38:1816–1822 （doi 10.1093/bioinformatics/btac058）。