上篇：從一堆變異到一棵腫瘤演化樹

為什麼重要

課程模組至 Capstone 為止。前述各章所回答的均為同一類問題： 某個位置是否存在變異、該變異位於哪一條染色體。 以下三頁轉向另一類問題，性質為研究方向的說明，而非課程。

重建的對象

腫瘤並非由單一均質的細胞群體構成。它自單一細胞起始， 於分裂過程中持續累積 somatic 變異somatic variant 體細胞變異在非生殖系細胞譜系中、通常於受精後取得的變異；可只存在於部分細胞，通常不由親代遺傳給子代。癌症基因體學常分析此類變異。A variant acquired outside the germline, usually after conception. It may be restricted to a subset of cells and is generally not passed to offspring; it is a central focus of cancer genomics.完整條目 →，因而分化為數個群體， 各自帶有不同的變異組合；M2 稱這些群體為 cloneclone 克隆源自共同祖先細胞，並共享一組可辨識 somatic mutations 的細胞群。A population of tumour cells descended from a common ancestor and sharing the same set of somatic mutations.完整條目 → 與 subclonesubclone 次克隆clone 內取得額外變異並擴增的子群；治療後可能富集具有抗性的 subclone。A subset of a clone that acquired further mutations and expanded. Treatment-resistant populations are often subclones.完整條目 →。

這些群體之間存在先後關係：某一群衍生自另一群。 將「何者衍生自何者」表示為圖，即得一棵樹 —— 節點為一群細胞，邊代表「在祖先既有的變異之上再取得一個」。 此樹稱為 clone treeclone tree 克隆演化樹描述腫瘤內各群細胞祖先關係的樹：節點是一群帶有相同變異組合的細胞，邊代表在祖先之上又多拿到變異。要注意同一組群集常常有多棵樹同時相容。A tree describing ancestral relationships among cell populations in a tumour: nodes are groups of cells sharing a mutation set, edges represent additional mutations acquired on top of an ancestor. Multiple trees are often compatible with the same clusters.完整條目 →，即為以下三頁所要重建的對象。

困難在於中間一格：觀測資料既不包含該樹，也不包含任何一顆完整的細胞。 bulk 定序將所有細胞打碎並混合，可得者僅有片段與頻率，樹須由此反推。

重建的價值

• 用藥 —— 兩個可標靶的變異若位於同一群細胞，單一藥物可能同時作用於兩者； 分屬兩群則否。此即 M0 開篇的問題。
• 抗藥 —— 治療後復發者通常源自原已存在的某一小群。 須先確定群體的組成與各自的比例，方能判斷防治的對象。
• 時序 —— 最早發生的變異，往往即為驅動該腫瘤生長的變異。

M9 的小規模示範

M9 以兩個位點示範過完整的流程：細胞僅會取得變異而不會回復， 故狀態由 00 轉為 10，再轉為 11； bulk read 在這兩個位置上即為一個 0／1 向量； 重建即為在狀態方格上尋找一棵樹，自 00 出發、每一步僅翻轉一個位元、 可達所有觀測狀態且步數最少。

以下三頁處理的是同一問題的放大版本 —— 由兩個位點放大至數千個變異， 由單一連鎖視窗放大至整個基因體。放大之後出現兩個在小規模下不顯現的問題， 而這三頁即針對該二問題。

三篇的分工

以下一項性質貫穿全篇。此問題已有二十年的研究史， 而它具有一項根本的性質：同一份資料可支持不只一個答案。 一項跨機構評比將 31 個 subclone 重建程式置於 51 個模擬腫瘤上執行，共 12,061 次 （2024 年線上發表，2025 年正式刊出）。其結論並非某一程式較為準確，而是 —— 更換程式對結果的影響大於更換腫瘤。

同一份輸入、不同程式、不同答案，而各個答案皆與資料相符。 此現象並非實作缺陷所致，而是資料本身未攜帶足以唯一決定答案的資訊。 上篇要確立的是：所缺的是哪一部分資訊、短讀資料何以無法取得它， 以及長讀取得該資訊之後，問題的結構如何改變。

概念與互動

此路線的四個轉折

以下先回顧此領域的發展。四個轉折各自解決了前一階段的一個問題， 同時各自留下新的問題。

第一步：將一批變異的頻率繪為直方圖 —— mutation frequency spectrum

設一份腫瘤樣本含數千個 somatic 變異，各自具有其 VAFVAF 變異等位基因頻率在某個位點上，支持 alt allele 的 read 佔全部 read 的比例。VAF 不等於帶有這個突變的細胞比例。Variant Allele Frequency: the fraction of reads supporting the alternate allele. Not the same as the fraction of cells carrying it.完整條目 →。 將這數千個 VAF 繪為直方圖，可得一張具有結構的圖， 稱為 mutation frequency spectrummutation frequency spectrum 突變頻率譜把一份樣本裡所有 somatic 變異的 VAF 畫成直方圖後得到的分布。分布上的峰與肩對應不同大小的細胞群，最低頻端的尾巴斜率則被用來判斷有沒有天擇。The distribution obtained by histogramming the VAFs of all somatic variants in a sample. Peaks and shoulders correspond to cell populations of different sizes; the slope of the low-frequency tail is used to test for selection.完整條目 →。

2014 至 2015 年間出現三項影響最大的做法，其思路均為對此圖分群： SciClone（2014）以 beta 混合模型（以數個鐘形分布擬合一張直方圖）擬合 VAF， 且主要僅採用拷貝數正常、無 LOHLOH 異型合子性喪失原本 heterozygous 的區域變成只剩一種 allele。LOH 不等於缺失 —— 也可能是一條 haplotype 遺失後另一條被複製（copy-neutral LOH）。Loss of heterozygosity: a formerly het region retains only one allele. Not necessarily a deletion.完整條目 → 的區段，因為僅該處的 VAF 易於解釋。 PyClone（2014）改以 Dirichlet process（不需預先固定群數的分群模型） 對「帶有該變異的細胞比例」分群，並將 拷貝數copy number 拷貝數某段基因體在細胞內的拷貝數。多數正常常染色體區段為 2，可再分為 major 與 minor allele copy number。How many copies of a genomic segment a cell carries; a typical diploid autosomal segment has two. It can be split into major- and minor-allele copy numbers.完整條目 →與正常細胞的混入一併納入模型。 PhyloWGS（2015）進一步將分群與建樹合為同一個推論。

2016 年出現另一種取徑：不進行分群，而直接分析分布的形狀。 其機制為：腫瘤指數成長時，發生越早的變異出現於越多細胞中，而此類變異本身數量越少。 將「出現於至少比例 f 以上的變異」計數，該累積數量在中性演化下正比於 $1/f$， 故累積曲線對 $1/f$ 作圖為一條直線。 在 14 種癌別、904 個腫瘤中，有 323 個符合此直線關係。

以下兩點須予區分。 其一，直線為累積曲線的性質，而非直方圖的性質 —— 直方圖本身的形狀為 $1/f^2$（累積曲線的微分），直接量測直方圖的斜率將得到錯誤的指數。 其二，原始研究刻意僅在 VAF 0.12 至 0.24 一段擬合： 更低頻的一端混有假陽性，更高頻的一端已進入 clonal 峰。

後續研究指出符合中性的比例可能被高估 —— driver 變異的頻率本即偏向 0 與 1 兩端，不易在中間頻率被觀測到， 故「該線為直線」不等同於「不存在天擇」。

由 VAF 至 CCF：換算所需的分母

前述分群的對象並非 VAF，而是 CCFcancer cell fraction 癌細胞比例帶有某個特定突變的腫瘤細胞佔全部腫瘤細胞的比例。用來區分 clonal（$\approx 1$）與 subclonal（$<1$）突變。不等於 VAF。The fraction of tumour cells carrying a given mutation; distinguishes clonal from subclonal. Not the same as VAF.完整條目 →。 理由已見於 M8：VAF 為「帶變異的 read 所佔比例」，CCF 為「帶變異的癌細胞所佔比例」， 兩者相差一段換算。

換算式的分母並非 2：

因此頻率路線的第一層不確定性源於換算：CCF 為三個估計值的商， 而三者皆可能偏誤。此層已於 M8 標記為「重要區分 #3：VAF 不等於 cancer cell fraction」。

以下互動用於確認一項關係：CCF 固定時，純度改變會使 VAF 如何移動。 峰的位置之所以可反推純度，依據即為此關係。

群集之後：clone tree 仍不唯一

設換算完全正確，得到三群變異，CCF 分別為 1.0、0.6、0.3。 其次須將此三群排為一棵 clone treeclone tree 克隆演化樹描述腫瘤內各群細胞祖先關係的樹：節點是一群帶有相同變異組合的細胞，邊代表在祖先之上又多拿到變異。要注意同一組群集常常有多棵樹同時相容。A tree describing ancestral relationships among cell populations in a tumour: nodes are groups of cells sharing a mutation set, edges represent additional mutations acquired on top of an ancestor. Multiple trees are often compatible with the same clusters.完整條目 →，即確定何者為何者的祖先。

可用的約束僅有一條，且屬純粹的算術：一群細胞的數量不可能多於其祖先。 故子節點的 CCF 不得超過父節點；若一個節點有兩個子節點，兩者的 CCF 之和亦不得超過該節點。

在此情形下，方法必須引入額外的偏好。最常用者為 簡約parsimony 簡約法在所有與資料相容的解裡，選步數（或成本）最少的那一個。它是一個偏好而不是證據 —— 當多個解並列時，簡約法決定選哪一個，但資料本身沒有排除其他解。Choosing, among all solutions compatible with the data, the one requiring the fewest steps or lowest cost. It is a preference rather than evidence: when several solutions tie, parsimony picks one, but the data has not ruled the others out.完整條目 →： 於所有相容的樹中選取步數最少者。此為合理的偏好，但它是偏好，而非證據。 此外，為使樹得以連通，有時須補入未獲任何資料直接支持的中間狀態， 此類節點稱為 latent nodelatent node 潛在節點建樹時為了讓圖連得起來而補進的中間狀態，沒有被任何 read 直接觀測到。它是模型的產物，不能當成「還沒觀察到的細胞」。An intermediate state added during tree construction to keep the graph connected, not directly observed in any read. It is a product of the model and must not be read as an unobserved cell population.完整條目 →。

以兩個位點即可說明其必然出現的原因。設僅觀測到 00 與 11 兩種狀態，無任何一條 read 為 10 或 01。 但每一步僅能增加一個突變，故由 00 至 11 之間必然經過 10 或 01。方法只能補入其一，而所補入者 係「模型為連通所假設」，並非觀測所得。

成因：頻率為 marginal distribution，樹所需者為 joint distribution

前述兩層不確定性表面上為兩個獨立的問題，實則同一。以兩個位點即可完整說明。

設一個連鎖視窗內有兩個 somatic 位點 A、B。頻率給出兩個數字： A 出現於 50% 的細胞、B 出現於 30% 的細胞。 此二數字各自描述單一位點，此類分布稱為 marginal distributionmarginal distribution 邊際分布只描述單一變數的分布。VAF 與甲基化 β 值都是邊際統計：它們各自只講一個位點有多少比例帶有標記，不講兩個位點在同一個分子或同一個細胞上的搭配情形。A distribution over a single variable. VAF and methylation beta values are both marginal statistics: each describes one site in isolation and says nothing about how two sites co-occur on the same molecule or cell.完整條目 →。

而樹所要回答的問題為：同時帶有 A 與 B 的細胞佔多少。 此為兩個位點聯合的分布，稱為 joint distributionjoint distribution 聯合分布多個變數一起看的分布，也就是「哪些組合各出現多少」。演化樹的形狀取決於聯合分布，而不是邊際分布；長讀的價值在於一條分子上的組合是直接觀測到的。A distribution over several variables jointly, i.e. how often each combination occurs. Tree topology depends on the joint distribution, not the marginals; the value of long reads is that combinations on one molecule are observed directly.完整條目 →。 由邊際分布無法推得聯合分布 —— 此非統計方法不足，而是該資訊確實不存在於資料中。

更精確地說，邊際並非全無作用，它給出一個區間： 同時帶有兩者的比例至多不超過 0.30（不可能多於帶有 B 者）， 至少不低於 $0.50+0.30-1=0$（兩者可完全不重疊）。 故邊際將答案限定於 0 至 0.30 之間，而此區間無法再行收窄。 樹的形狀在此區間的兩端則完全不同。

回到前述兩層不確定性，兩者為同一件事的兩個面向： CCF 換算是在估計邊際，簡約性則是在推定聯合。 短讀路線的每一項模型假設，都是在補足聯合分布這一格。

甲基化面臨同一限制：β 值與 epiallele

既然序列上的頻率不足，更換標記是否有所改善？甲基化5mC 5-甲基胞嘧啶胞嘧啶第 5 個碳上的甲基化修飾。這是常見的 DNA 甲基化形式，主要見於 CpG；可影響轉錄調控，效應依基因組位置與細胞類型而異。5-methylcytosine, the commonest DNA methylation mark, usually at CpG sites. Affects expression without changing sequence.完整條目 →為自然的候選。

其吸引力在於速率。epimutationepimutation 表觀突變細胞分裂時甲基化狀態的隨機翻轉。文獻常引的量級是每個 CpG、每次分裂 ${10}^{-5}$ 到 ${10}^{-4}$，而 DNA 突變約每鹼基 ${10}^{-9}$ 到 ${10}^{-10}$，同量級對比約差五個數量級，所以甲基化是解析度更高的譜系時鐘。要注意這個速率隨位點與量測方式差異很大（有估到 ${10}^{-3}$ 的），應當成量級而非定值。A stochastic flip of methylation state during cell division. Commonly cited at ${10}^{-5}$–${10}^{-4}$ per CpG per division versus ${10}^{-9}$–${10}^{-10}$ per base for DNA mutation — roughly five orders of magnitude faster like-for-like — which makes it a higher-resolution lineage clock. Treat it as an order of magnitude, not a constant: estimates vary by site and assay, up to ~${10}^{-3}$.完整條目 →（甲基化狀態的隨機翻轉）的發生速率， 文獻常引的量級為每個 CpGCpG序列上一個 C 後接一個 G（p 代表兩者之間的磷酸鍵）。哺乳類多數 5mC 位於 CpG，特定細胞或情況亦可見非 CpG 甲基化。A cytosine followed by a guanine. Most mammalian 5mC occurs at CpG sites, although non-CpG methylation is also observed in particular cells and contexts.完整條目 →、每次細胞分裂 ${10}^{-5}$ 至 ${10}^{-4}$；DNA 突變則為每個鹼基 ${10}^{-9}$ 至 ${10}^{-10}$。 同量級相比，快約五個數量級。此即表示甲基化為解析度高得多的時鐘 —— 兩群細胞分離僅數十代時，序列上尚無任何差異，甲基化上已可觀測。

該速率應視為量級而非定值：它隨位點與量測方式差異甚大， 專供作時鐘之用的位點另有估至 ${10}^{-3}$ 量級者。 故「甲基化快得多」一項穩固，「快幾個數量級」則不宜作為定值引用。

此取徑已達規模化。2015 年一項研究取 19 位低度膠質瘤病人的原發與復發檢體， 分別以甲基化與以突變建樹，兩棵樹高度吻合（相關係數 0.56 至 0.90）， 顯示甲基化所攜帶的譜系訊號為真 —— 惟其為「高度吻合」而非「同一棵樹」， 該研究中亦有病人的甲基化訊號跨越了基因型上已分離的分支。 2025 年的一項研究更進一步：僅以 bulk 甲基化資料，在 1,976 個淋巴系癌樣本上 推估腫瘤的生長速率與發生年齡，不需定序基因體。

然而甲基化的常規讀法具有相同的限制。單一 CpG 位點的甲基化程度以 β 值表示， 即該位點所有分子中甲基化者的比例。此亦為一個邊際。

2014 年的 methclone 即在執行此項工作：它自 read 直接計數 epiallele 的組成， 再以組成的熵變化量衡量兩個時間點之間譜系結構的改變。

短讀相對於此門檻的位置

人類基因體約有 2,800 萬個 CpG，分布於 3.1 Gb 上， 平均每 100 bp 一個。CpG island 內部則密集得多，約每 10 至 20 bp 一個。

長讀將 joint distribution 轉為直接觀測

至此轉折已明確。一條 long readlong read 長讀單條可達數千至數萬鹼基的定序片段（例如 ONT、PacBio）。若可靠地同時覆蓋多個 variant，可提供它們位於同一 DNA 分子上的直接觀測證據。A sequencing read thousands to tens of thousands of bases long. Its length lets one molecule link multiple variants directly.完整條目 → 對應一個分子， 其在多個位點上的 allele 為一次觀測所得的組合，而非由兩個邊際推得。 亦即：聯合分布不需推估，可直接計數。

以下例說明兩者的差異。同一顆腫瘤、同樣兩個 somatic 位點、同樣十條分子， 兩種讀長所算得的 VAF 完全相同，故差異僅可能來自組合是否可觀測：

此例的關鍵在於被排除的那一格。 短讀一側並非量測較不準確 —— 其兩個 VAF 與長讀完全相同 —— 而是缺少一種觀測：哪一種組合為空。 邊際頻率不提供此資訊，而該空缺的一格正是決定樹形者。

與前述區間的說法對照：邊際僅將「同時帶有兩者的比例」限定於 0 至 0.30 之間， 兩端各對應一棵樹，中段無法收窄。此例中長讀將該比例直接計數為 0.30， 恰為區間的上界，即「帶有 B 的細胞全部亦帶有 A」，區間收斂為一點，樹因而確定。

M9 已說明此觀測的形式：將每條 read 在 k 個 somatic 位點上的 R／A 記為 0／1 向量， 即得一張狀態表；求步數最少且可達所有觀測狀態的樹，即為該連鎖視窗的候選演化次序。 在本頁的座標中，該狀態表即為聯合分布的直接樣本， 而非 CCF 群集那類邊際的整理。

惟狀態表的每一列對應分子而非細胞，此點易生誤讀。 單一細胞的兩條染色體會產生兩條不同 haplotype 的 read，同一條染色體亦可能被多條 read 覆蓋。 故「狀態 11 有 6 條 read」不等同於「有 6 個細胞同時帶有兩個變異」。 此即 M0「read 為分子片段的觀測，而非細胞標籤」一項警告在此路線上的具體後果。

尚有第二層結構須先區分。somatic 變異somatic variant 體細胞變異在非生殖系細胞譜系中、通常於受精後取得的變異；可只存在於部分細胞，通常不由親代遺傳給子代。癌症基因體學常分析此類變異。A variant acquired outside the germline, usually after conception. It may be restricted to a subset of cells and is generally not passed to offspring; it is a central focus of cancer genomics.完整條目 →發生於某一細胞的某一條染色體上， 故同一個 somatic 位點的變異僅會出現於其中一條 haplotypehaplotype 單倍型同一條實體染色體拷貝上，具有一致相位的一組 alleles 或 variants。HP1 與 HP2 是任意的相對標籤。A set of variants that lie on the same physical chromosome copy and are inherited together.完整條目 → 上。 先將 read 依 單倍型家族單倍型家族 一條 germline 單倍型，加上由它衍生的 somatic 單倍型把 read 依 HP tag 分成的兩組之一。家族一是 HP1 與從它長出來的 HP1-1，家族二是 HP2 與 HP2-1；歸不到任何一條 germline 單倍型的 HP3 不屬於任何一族。叫「家族」是因為它把一條 germline 單倍型與由它衍生的 somatic 單倍型收在同一組裡 —— 分組看的是 germline 那一層，不是有沒有帶 somatic 突變。

在同一個 phase block 內，一個家族對應一條染色體拷貝，所以「兩族」就是那個位置上的兩條同源染色體。但兩件事不成立：其一，軟體判定不出哪一族來自父親、哪一族來自母親（那需要另外定序父母）；其二，標號只在該 phase block 內有定義，跨 block 的「家族一」並非同一條染色體。One of the two groups reads are split into by HP tag. Family 1 is HP1 plus the somatic haplotype HP1-1 derived from it; family 2 is HP2 plus HP2-1; HP3, which cannot be assigned to either germline haplotype, belongs to neither. It is called a family because it groups a germline haplotype together with the somatic haplotypes descended from it — the split is by the germline layer, not by whether a read carries a somatic mutation. Within one phase block a family corresponds to one chromosome copy, so the two families are the two homologous chromosomes at that locus. Two things do not follow: which family is paternal cannot be determined without sequencing the parents, and the labels are defined only within that phase block.完整條目 →分為兩組再各自建樹， 一方面符合生物學，一方面使各組的狀態空間減半。

代價：分析單位縮小為單倍型連鎖區段

聯合觀測有其代價：它僅在單一條 read 可跨越的距離內成立。 兩個位點若相距 100 kb，無任何一條 read 同時覆蓋兩者， 則該二位點之間的聯合分布與短讀時期同樣未知。