上篇：純度、倍體與拷貝數為何只能一起估計

為什麼重要

三個名稱相近而分母不同的量

M8 已建立 VAFVAF 變異等位基因頻率在某個位點上，支持 alt allele 的 read 佔全部 read 的比例。VAF 不等於帶有這個突變的細胞比例。Variant Allele Frequency: the fraction of reads supporting the alternate allele. Not the same as the fraction of cells carrying it.完整條目 → 的完整關係式，並示範同一個 VAF ＝ 0.20 可由三種不同的細胞狀態產生。 該章將「估計腫瘤細胞比例」列為一個獨立的研究題目，本頁即為該題目的標準解法。

討論之前須先分開三個量，其分母各不相同：

沿用 M8 的四倍體例子：$p=0.50$、$\kappa =4$ 時 $f=0.667$， 兩者相差 16.7 個百分點。反解式為 $p=\frac{2f}{\kappa (1-f)+2f}$。 M8 的重要區分 #2 已建立此一分家，本頁承接其後果： 凡以 $f$ 為輸出的方法，其結果與以 $p$ 為輸出的方法不可直接比較， 除非同時取得 $\kappa$。

此換算式沒有任何一篇文獻將其列為編號式。它是 ABSOLUTE 所定義的 $D=\alpha ·\tau +2(1-\alpha )$（樣本平均拷貝數）與該文 「the smallest possible value is 2(1−α)/D … corresponds to the fraction of DNA from normal cells」 一語的直接推論：正常細胞所貢獻的 DNA 比例為 $2(1-p)/D$，其補數即為 $f$。 同一個 $D$ 在 ASCAT 記為 $\psi$，在 PURPLE 為 normFactor 的倒數的兩倍。

本頁的範圍

以下以 ASCAT 與 PURPLE 為對照基準，兩者皆自 B-allele frequencyB-allele frequency B 等位頻率在 germline heterozygous 位點上，兩個等位其中一個所佔的 read 比例。腫瘤樣本中混入的正常細胞在此值上恆為 0.5，該常數即為反推純度所依據的錨。ASCAT 與 PURPLE 皆刻意不做相位，故其標號在各位點之間獨立。The fraction of reads carrying one of the two alleles at a germline heterozygous site. Contaminating normal cells contribute exactly 0.5, and that constant is the anchor from which purity is recovered. ASCAT and PURPLE deliberately do not phase, so the A/B label is independent per site.完整條目 → 與定序深度 同時估計純度、倍體與 等位特異拷貝數allele-specific copy number 等位特異拷貝數把一個區段的總拷貝數拆成兩個親源等位各自的份數，通常記為 major 與 minor。總拷貝數相同而兩個等位不同的狀態（例如 2+0 與 1+1）在深度上完全一致，只有 B-allele frequency 分得開 —— copy-neutral LOH 即為此類。The total copy number of a segment split into the counts contributed by each parental allele, usually reported as major and minor. States with equal total but different split (2+0 versus 1+1) are identical in depth and separable only by B-allele frequency; copy-neutral LOH is exactly such a case.完整條目 →。 所要建立的並非其操作流程，而是四件事：前向式的形式、反解式、 解為何不唯一，以及兩者各以什麼手段選出其中一個。

最後一項為本頁的重點，亦為下篇的起點： 簡併不是估計精度的問題，而是可辨識性的問題，兩者的改善途徑完全不同。

概念與互動

一、兩條觀測軌道

兩者的輸入皆可化約為沿基因體排列的兩條軌道。

深度比logR 深度比對數同一位點上腫瘤與正常樣本的 read 深度比取以 2 為底的對數。ASCAT 再以全基因體比值的平均重新置中，因此 0 並不代表兩份拷貝 —— 倍體須由擬合結果另行推算。單獨的 logR 只能決定拷貝數輪廓至一個仿射變換。The base-2 logarithm of the tumour-to-normal read-depth ratio at a locus, re-centred on the genome-wide mean ratio. Zero therefore does not mean two copies; ploidy has to be recomputed from the fitted profile. logR alone determines the copy-number profile only up to an affine map.完整條目 →為同一位點上腫瘤與正常樣本的 read 深度比取以 2 為底的對數。 ASCAT 的實作（ascat.prepareHTS.R 的 ascat.getBAFsAndLogRs） 在取對數之後，再以全基因體比值的算術平均重新置中。

B-allele frequencyB-allele frequency B 等位頻率在 germline heterozygous 位點上，兩個等位其中一個所佔的 read 比例。腫瘤樣本中混入的正常細胞在此值上恆為 0.5，該常數即為反推純度所依據的錨。ASCAT 與 PURPLE 皆刻意不做相位，故其標號在各位點之間獨立。The fraction of reads carrying one of the two alleles at a germline heterozygous site. Contaminating normal cells contribute exactly 0.5, and that constant is the anchor from which purity is recovered. ASCAT and PURPLE deliberately do not phase, so the A/B label is independent per site.完整條目 →僅在 germline heterozygous 位點計算。 germline homozygous 位點在腫瘤與正常樣本中皆為 0 或 1，對純度零資訊，故予以剔除。 兩個等位的 A／B 標號逐位點隨機決定（selector = round(runif(len))）—— ASCAT 刻意不做相位，因此其等位軌道對稱於 0.5，PURPLE 的 AMBER 則取兩者較大值，值域為 $[0.5,1]$。此設計選擇在下篇會再度出現。

深度單獨可決定的量

深度軌道對每個區段給出一條式子 $L_i=\rho ·n_i+2(1-\rho )$， 其中 $n_i$ 為該處的總拷貝數。但 $L_i$ 本身只能讀到相差一個未知的正規化常數 （前述的重新置中），故實際可得的是 $n_i$ 的一個仿射像： 斜率為 $\rho$、截距為 $2(1-\rho )$，兩者皆未知。

凡能將這批數值落到整數上的一組（斜率, 截距）皆可接受。 第五節的格點族即為這類變換的全體。等位比例的作用，即在於為這條仿射線提供一個已知點。

二、前向式

令 $\rho$ 為純度、${\psi }_t$ 為腫瘤倍體、 $n_A$ 與 $n_B$ 為某區段上兩個等位在腫瘤細胞中的拷貝數。 樣本的平均倍體為 $\psi =2(1-\rho )+\rho ·{\psi }_t$。前向式為：

$\gamma$ 為平台常數，其操作定義為「純樣本中單一拷貝缺失所造成的深度比下降量」。 SNP 陣列取 0.55，定序資料一律取 1。它以 $2^{r/\gamma }$ 的形式進入反解， 故設錯將使所有拷貝數整體縮放。

三、反解式

令 $L_i=2^{r_i/\gamma }·\psi$，即去正規化之後該處的 DNA 總量，則

整數拷貝數由 $\max \left(\mathrm{round}\right(\widehat{n}),0)$ 得出。 關鍵在於：$\rho$ 與 ${\psi }_t$ 為輸入而非輸出。 反解式對任一組 $(\rho ,{\psi }_t)$ 皆給得出一組 $\widehat{n}$， 唯有這組 $\widehat{n}$ 恰好落在整數附近時，該組 $(\rho ,{\psi }_t)$ 才被視為合理。 擬合的目標即為此「與整數的距離」。

四、等位比例何以能定出純度

關鍵在等位比例式分子中的 $(1-\rho )$ 一項。 混入的正常細胞在 germline heterozygous 位點上的等位比例恆為 0.5， 且該值與 $\rho$ 無關 —— 它是一個已知常數，故構成錨。兩個可直接反推純度的特例：

兩式皆不需要深度資料。PURPLE 對高度非整倍體樣本的重新擬合門檻 $2\times 0.92-1$ 即為第二式的直接應用：取等位比例 0.92 之處反推純度。

五、簡併的代數形式

變換式

設 $(\rho ,{\psi }_t,n)$ 為一組解，其中 $n$ 為區段的總拷貝數。 取整數 $k\ge 1$ 與整數 $m$，令每個等位的拷貝數變為 $k·n_A+m$ 與 $k·n_B+m$，故總拷貝數變為 $n\prime =k·n+2m$，倍體隨之為 ${\psi }_t\prime =k·{\psi }_t+2m$。

深度式為 $n$ 的仿射函數，且兩個解皆將各自的倍體映至 1 （代入 $n={\psi }_t$ 即得），故兩者相等的唯一條件為斜率相同： $\rho \prime ·k/\psi \prime =\rho /\psi$。解出 $\rho \prime$ 得

亦即：$(\rho ,{\psi }_t)$ 的解成一個由 $(k,m)$ 索引的格點族， 族中每一點對深度與等位比例給出完全相同的觀測值。三個具體的格點：

圖中三欄的數值可逐項驗算。以左欄的 $\rho =0.40$、${\psi }_t=2.00$ 為例， $\psi =2(1-0.40)+0.40\times 2.00=2.00$； $1+0$ 的區段其深度比為 $(0.40\times 1+1.20)÷2.00=0.80$， 等位比例為 $(0.40\times 1+0.60)÷(0.40\times 1+1.20)=0.625$。 中欄的 $\rho =0.25$、${\psi }_t=4.00$ 與 $2+0$ 代入後給出同樣的 $0.80$ 與 $0.625$。

加倍為何不可辨識

$(k,m)=\left(\mathrm{2,}0\right)$ 時 $\rho \prime =\rho /(2-\rho )$。 代入 $\rho =1$ 得 $\rho \prime =1$：一個全部拷貝數皆為偶數的純四倍體樣本， 與一個純二倍體樣本，在深度與等位比例上逐點相同。 兩者並非近似相等，而是恆等，故任何以這兩條軌道為輸入的方法皆不可能區分。 ASCAT 原始文獻在 79 例的驗證中有 10 例（12.7%）落於此點，該文亦明白寫出此限制。

此處與上一節的錨相互印證：$\rho =1$ 時正常細胞的錨消失， 而正是在該處加倍的簡併最為徹底。

六、ASCAT：以硬性可行域選解

ASCAT 在 $(\rho ,{\psi }_t)$ 的二維網格上（純度步長 0.01、倍體步長 0.05） 逐點計算反解，並取下式為距離：

此處有三項與原始文獻的敘述不一致，須以原始碼為準： 現行版本僅使用較小的等位且取平方，文獻所述為兩個等位的絕對值之和； 擬合優度定為 $(1-d/d_{\max })\times 100$，而 $d_{\max }$ 以線性的 0.25 累計 —— 分子取平方而分母不取，故所報告的百分比不在文獻所述的尺度上，且系統性偏高。 引用該數值時應說明其定義。

格點族在此曲面上表現為多個深度相近的局部極小。 ASCAT 取 7×7 鄰域內的嚴格極小為候選，再以四道硬性條件篩選：

• 倍體須落於 $[1.5,5.5]$
• 純度須不低於 0.20（常數 MINRHO）
• 零拷貝的區段須佔全基因體 2% 以上 —— 即上一節用以定住 $m$ 的條件
• 擬合優度須不低於 80

四道皆不通過時，ASCAT 回傳 NA 而非一個勉強的解。 其原始文獻報告 112 個樣本中有 21 個（19%）如此，並將成因歸於深度軌道的殘差過大。 此一設計值得留意：回報失敗與回報一個錯誤的數值，其下游後果不同， 前者會使分析停下來，後者不會。

權重 0.05 的後果：接近二倍體的樣本

距離式中的 $w_i$ 對等位比例為 0.5 的區段取 0.05， 其理由是這類區段對任何一組 $(\rho ,{\psi }_t)$ 都給出接近整數的 ${\widehat{n}}_{\min }=0$ 或 1， 不具鑑別力。但其後果是：一個接近二倍體、拷貝數變異稀少的腫瘤， 其絕大多數區段的權重皆為 0.05，距離曲面沿 $\rho$ 的方向近乎平坦， 沒有可供辨識的極小。

ASCAT 對此設有明確的判定：等位失衡的區段比例不足 3% 且最大的失衡區段不足 0.5% 時，樣本被標記為非異常， 前兩輪的解全數不予採用。此為第八節末兩列所述「全基因體皆為 1+1 時純度不可辨識」 在實作上的具體對應 —— 這不是實作的缺陷，而是可辨識性的邊界被正確地偵測到了。

PURPLE 對同一情形的處置方向相反：它不停下來，而是改用另一種資料 （見下一節的 somatic 擬合退路）。兩者在此處的分歧，正是各自失效模式的來源。

七、PURPLE：同一組代數，連續的先驗

模型部分完全相同

PURPLE 的 PurityAdjuster.expectedFrequency 展開之後即為前述的等位比例式：

深度側為 $\mathrm{ratio}=\nu ·\frac{p·\mathrm{CN}+2(1-p)}{2}$， 其中 $\nu$ 即 normFactor，對應 ASCAT 的 $2/\psi$。 換言之，PURPLE 的觀測模型與 ASCAT 相同，取 $\gamma =1$、$\nu =2/\psi$。 兩者的差別完全落在目標函數上。

事件懲罰：連續的簡約先驗

兩項分別為「由 1+1 出發所需的事件數」與「先加倍再由 2+2 出發所需的事件數」， 後者的 $+1$ 即加倍事件本身的代價。此式取代了 ASCAT 的硬性倍體界限： 它不禁止高倍體的解，而是要求該解在其他方面補回這筆代價。

偏離懲罰：對雜訊敏感

$p·\nu /2$ 為相鄰整數拷貝數之間在深度比上的間距，除以 $\sigma$ 之後即為 「每一份拷貝相當於幾個標準差」。因此同樣 0.25 的整數偏離， 在高純度樣本上幾乎必然來自 subclonal 拷貝數，在低純度樣本上則落於雜訊之內。 下限 1.5 使此一放寬在 $p·\nu \approx 0.15$ 之下停止。

ASCAT 沒有這一層：它在純度 0.2 與 0.9 上採用同一個絕對容差。 此為兩者在低純度樣本上表現分歧的機制之一。

somatic 變異提供的兩種約束

PURPLE 另有一項 ASCAT 完全不具備的輸入：somatic 變異的 VAF。它以兩種方式使用。

其一為懲罰項。由候選解換算每個 somatic 變異的變異拷貝數， 若其超出該區段主要等位所能容納的二項上界，則計入 $\mathrm{SomaticPenalty}$。 PURPLE 的文件明白寫出此設計的目的：低純度低倍體的候選解往往能擬合拷貝數資料， 卻蘊含大量超出主要等位拷貝數的變異，而該情形在生物學上不合理。 此即一個針對格點族設計的排除機制。

其二為退路。當候選解高度二倍體（比例 $\ge 0.97$） 且有效純度範圍寬達 $0.15$ 以上時 —— 即拷貝數資料本身不足以定出純度 —— PURPLE 轉而直接使用 somatic 變異的 VAF。 在 1+1 區段上，一個 clonal、multiplicity 為 1 的 heterozygous somatic 變異，其期望 VAF 為

故以核密度估計找出 VAF 的最高峰，取其兩倍為純度。 此模式下倍體被逕行設為 2，因為該路徑本身不含倍體資訊。

非整數的拷貝數與 subclonality

ASCAT 的模型嚴格為 clonal：全部腫瘤細胞在每個區段上共用同一組拷貝數。 subclonal 的拷貝數變異因此表現為真正非整數的 $\widehat{n}$，直接推高距離， 並可能使極小點位移。ASCAT 的說明文件亦建議改用其他工具處理 subclonal 拷貝數。

PURPLE 亦未在擬合中建立 subclonal 的混合模型，但它允許輸出非整數的拷貝數， 並另行回報兩個量：多克隆比例（與整數相距超過 0.25 的區段所佔的比例）， 以及每個 somatic 變異的變異拷貝數

再以峰值分解在 $\mathrm{VCN}$ 的分布上找出各峰，將峰值低於 0.85 者標記為 subclonal。 此處要留意其位階：subclonality 是在純度與倍體確定之後才被處理的， 並未回頭參與擬合。若真實樣本的 subclonal 拷貝數變異範圍甚廣， 則 $(p,\kappa )$ 的估計已先受其影響，而該影響不會出現在多克隆比例之外的任何指標上。

相關常數（以程式碼為準）：純度搜尋下限 0.08、步長 0.01； 倍體搜尋範圍 $[1.0,8.0]$；事件懲罰係數 0.4；$\sigma =0.05$、下限 1.5； 等位比例的模糊門檻 0.535；somatic 擬合的純度下限 0.17；品質警示門檻為純度低於 0.20。 其公開文件在事件懲罰係數、基礎偏離量與純度步長三處與程式碼不一致，引用時以程式碼為準。

八、可辨識與不可辨識的量

末兩列即為此路線的邊界。可用以跨越該邊界的錨依強度排序如下：

1. somatic 變異的 VAF。變異的拷貝數須為不超過主要等位的正整數， 且 clonal 變異在 1+1 區段的 VAF 恆為 $p/2$。 此為同一份資料之內最強的錨。惟其對加倍簡併的作用是有條件的： 起作用的並非 VAF 的數值本身（該值在加倍變換下不變）， 而是「變異拷貝數須為不超過主要等位的正整數」這條約束 —— 它使「把拷貝數對半」在需要半整數 multiplicity 時不可行。 因此它只在存在加倍之後才發生的變異、或對變異發生時序另有假設時才定得下模式。 下篇第七節以代數證明此點。
2. 零拷貝的證據。定住 $m$，但對 $k$ 無作用。
3. 簡約性偏好與群體先驗。PURPLE 的事件懲罰、ASCAT 的倍體界限皆屬此類。 其性質為偏好而非證據，樣本落在偏好之外時即失效。
4. 樣本外的量測。流式細胞術的 DNA 指數、FISH、病理判讀的腫瘤細胞比例。 可靠但需另行取得，且多數研究資料不具備。

第一項的形式值得留意：它之所以有效，是因為 somatic 變異的存在本身 對「這些分子來自腫瘤細胞」給出一個與拷貝數無關的計數。 但其可用範圍受限於 $\mathrm{VAF}=p/2$ 一式的成立條件 —— 該式的分母含兩條單倍型的拷貝數，故僅在二倍體區段成立， 而腫瘤基因體上二倍體區段往往不是多數。下篇處理的正是這個限制。

真實資料與證據

在 in silico 混合上的實測

LongPhase-S 的研究在 8 個 ONT 與 6 個 PacBio 細胞株資料集上， 以 M8 所述的方式（依實測 coverage 抽樣後合併）合成腫瘤 DNA 比例 0.2／0.4／0.6／0.8／1.0 的混合樣本，腫瘤側 50×、正常側 25×， 並將各估計器的輸出換算至同一個 $f$ 的尺度上比較：

低純度失效的機制

「期望值 0.2 而預測為 1.0」的偏差量遠大於任何合理的量測雜訊， 其成因為結構性的，可由前述兩節直接導出。

ASCAT 的純度下限 MINRHO = 0.2 為硬性條件， 自動搜尋在結構上不可能回傳低於此值的解。而格點變換的兩式 $\rho \prime =\rho /\left(k\right(1-\rho )+\rho (1-m\left)\right)$ 與 ${\psi }_t\prime =k·{\psi }_t+2m$ 對 $m$ 同向：$m$ 增加時前者的分母減小、後者直接增加， 故純度與倍體一併上升。

兩者相合的後果是：真值低於下限時，族中最接近而仍屬可行的解， 是 $m$ 較大的那一個，而它的純度與倍體同時高於真值。

因此純度與倍體是被一併推高的，而非各自帶有雜訊。 兩者的偏誤同向且相關，此為判別此類失效與量測誤差的依據： 量測誤差在重複實驗中會改變方向，格點跳躍不會。

兩個純度下限，數值不同

「此方法可偵測到多低的純度」一問有兩個答案，兩者皆屬實，適用的敘述不同。

PURPLE 原始研究的隊列即以 20% 為界：純度低於此值的 385 個樣本被排除， 理由是可靠而完整的 somatic 變異偵測在該純度之下不可行 —— 此與 M8「低 purity 對 somatic variant detection 的影響」一節所述為同一件事。 其說明文件亦指出，將搜尋步長由 1% 降至 0.5% 以下， 有可能在 0.08 之下取得擬合。兩個數字須分別引用： 談「演算法能回傳什麼」時用前者，談「結果可否採信」時用後者。

此一區別對本主題的重要性在於：LongPhase-S 所報告的優勢集中在 腫瘤 DNA 比例 0.2 及其以下的區間，而該區間恰為兩個對照方法各自的下限附近。 比較結果因此有一部分反映的是對照方法的設計範圍，而非其模型能力。

三項須注意的事項

其一，PURPLE 沒有數值，因此不能宣稱勝過它。 上表中 PURPLE 一列為空白，該研究對其表現的敘述僅為定性。 在跨平台的部分，PacBio 資料集上 PURPLE 與 LongPhase-S 皆能追蹤期望值， ASCAT 與 Battenberg 則否。可支持的結論是「優於 ASCAT」，而非「優於現行所有方法」。

其二，此比較的對象並非各方法原本的輸出。 ASCAT、PURPLE、Battenberg 輸出的是 $(p,\kappa )$，經 $f=p\kappa /(p\kappa +2(1-p\left)\right)$ 換算後才進入比較。換算式假設正常細胞為二倍體， 且把兩個各自帶有不確定性的量合併為一個； 倍體估計的偏誤會經此式傳遞至 $f$。上表的 0.19 因此同時包含純度與倍體兩處的偏誤。

其三，真值為 $f$ 而非 $p$。 依 read 比例合成的混合樣本，所控制的量是分子比例。 以此資料評比一個以細胞比例為輸出的方法時，須先將真值換算為 $p$， 而該換算需要來源細胞株的倍體。此點在下篇展開。

預測與結果檢視

與下篇的銜接

本頁的結論可歸為三句：深度與等位比例決定的是一個格點族而非一組解； 族內選點必須依賴錨或偏好；而同一份資料之內最強的錨是 somatic 變異的 VAF， 且其對加倍簡併的作用取決於整數 multiplicity 的約束，並非無條件成立。

該錨的限制已在第七節指出：$\mathrm{VAF}=p/2$ 的分母含兩條單倍型的拷貝數， 故僅在二倍體區段成立，PURPLE 因而只能在推得拷貝數落於 1.8 至 2.2 的區域使用它。

下篇處理的問題由此而生。當 read 已帶有單倍型標記時， 同一個 somatic 訊號可以在單一條單倍型之內計數 —— 分母因而不含另一條單倍型，上述限制隨之消失。 下篇先由原始碼寫出 LongPhase-S 現行統計量的閉式， 說明它與本頁的等位比例式為同一個形式，再據以建立聯合估計式。

原始文獻與程式碼

ASCAT：Van Loo P et al., Allele-specific copy number analysis of tumors, PNAS 2010;107:16910–16915（doi 10.1073/pnas.1009843107）； 多樣本分割見 Ross EM et al., Allele-specific multi-sample copy number segmentation in ASCAT, Bioinformatics 2021;37:1909–1911（doi 10.1093/bioinformatics/btaa538）。 程式碼在 github.com/VanLoo-lab/ascat。 本頁的前向式、反解式、距離函數與四道硬性條件的常數，均取自 ASCAT/R/ascat.runAscat.R 與 ASCAT/R/ascat.prepareHTS.R。

PURPLE：Priestley P et al., Pan-cancer whole-genome analyses of metastatic solid tumours, Nature 2019;575:210–216（doi 10.1038/s41586-019-1689-y）。 程式碼與說明文件在 github.com/hartwigmedical/hmftools 的 purple 之下。本頁的擬合分數、事件懲罰、偏離懲罰與各項常數，取自 PurityAdjuster.java、PloidyDeviation.java、FittedPurityFactory.java 與 PurpleConstants.java。

$f$ 的換算式源自 ABSOLUTE：Carter SL et al., Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer, Nat Biotechnol 2012;30:413–421（doi 10.1038/nbt.2203）。 Battenberg 見 Nik-Zainal S et al., The life history of 21 breast cancers, Cell 2012;149:994–1007（doi 10.1016/j.cell.2012.04.023）。

「真實資料與證據」一節的實測數值出自 LongPhase-S 的預印本 （bioRxiv, 2025，doi 10.1101/2025.11.20.689492）， 程式碼在 github.com/CCU-Bioinformatics-Lab/longphase-s。 參數名稱、欄位與常數一律以原始碼為準。